缺血后处理对缺血?再灌注大鼠肠黏膜的抗损伤作用
【摘要】 目的 探讨缺血后处理对缺血?再灌注大鼠肠黏膜的抗损伤作用。方法 复制SD大鼠肠缺血?再灌注损伤模型。实验分为4组(n=8)：假手术组(S)、缺血?再灌注组(I/R)、缺血预处理组(IPC)、缺血后处理组(I?post)。比较各组大鼠肠黏膜丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)的活性变化；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测肠黏膜细胞凋亡发生率；Chiu?s评分法观察肠黏膜的损伤情况。结果 与I/R组相比，IPC组和I?post组大鼠肠黏膜MDA含量和MPO活性均显著降低，而SOD活性明显升高；再灌注后可见明显的肠黏膜细胞凋亡现象，I?post组和IPC组凋亡指数较I/R组显著下降，组织病理损伤亦明显减轻。I?post组和IPC组相比，各项指标无显著性差异。结论 缺血后处理可通过抑制再灌注后氧自由基的过量产生，保护抗氧化系统，从而抑制肠黏膜细胞凋亡，减轻肠缺血?再灌注损伤。
【关键词】 缺血?再灌注；缺血后处理；缺血预处理；细胞凋亡；肠黏膜
肠缺血再灌注损伤与临床许多疾病和病理过程有密切关系，细胞凋亡在其损伤的病理过程中发挥重要作用[1?2]。1986年Murry等提出心肌在经受多次短暂缺血再灌后，能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌损伤，即缺血预处理。已证实，这一现象存在于不同种属的不同组织器官中[3?4]。但由于这种预处理需在缺血前施予，从而使其临床应用价值受限。Zhao等[5]于2003年首先在心脏缺血?再灌注损伤的实验研究中证明，在再灌注一开始采用数个循环的短暂的灌注/阻断之后全面恢复心脏的再灌注，能对缺血?再灌注心脏产生抗损伤作用，从而提出了一种新的外科干预措施——缺血后处理。随后的研究[6]也证实缺血后处理能够缩小心肌梗死范围，降低心律失常的发生率。这种缺血后处理对缺血?再灌注器官的抗损伤作用是否具有普遍性，目前尚不能确定。因此，本研究拟通过复制大鼠肠缺血?再灌注损伤模型，研究缺血后处理对缺血?再灌注大鼠肠黏膜的抗损伤作用，并探讨其可能的机制，为肠缺血?再灌注的临床提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，原位凋亡检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验动物
健康雄性Sprague?Dawley(SD)大鼠32只，体重230-280g，由昆明医学院实验动物中心提供，术前禁食12h，不禁水。
1.2.1 动物模型复制
腹腔注射200g/L乌拉坦(1g/kg)麻醉后，仰卧固定于操作板上，消毒后取腹正中切口长约3cm进腹，用温盐水纱布将肠管推向左侧腹腔，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)，在其根部用无创伤血管夹夹闭阻断SMA血运45min，造成肠缺血模型，然后松夹，再灌注1h后经颈动脉放血处死。
1.2.2 动物分组及处理
动物随机分为4组(n=8)：①假手术(S)组：仅行开腹，分离SMA不夹闭；②缺血?再灌注(I/R)组：方法见模型复制；③缺血预处理(IPC)组：夹闭SMA 5min和松夹5min作为预处理，2个循环，余同I/R组；④缺血后处理(I?post)组：缺血45min后即刻行3个循环的灌注30s/阻断30s，余同I/R组。
1.3 标本收集
动物被处死后，取小肠回盲部10cm以上的肠管。经冰盐水漂净，滤纸吸干，沿肠管长轴切开，用载玻片轻轻刮取肠黏膜部分，立即-70℃分装冻存，2cm肠组织经40g/L甲醛溶液固定，常规制备小肠全层组织石蜡切片，分别进行细胞凋亡检测和常规HE染色。
1.4 观察项目
①分光光度法测定肠黏膜MPO、SOD活性以及MDA含量。严格按照说明书操作。②光镜下观察组织形态学改变。按Chiu氏六级评分分析，取平均值。③TUNEL法检测肠黏膜细胞凋亡。按TUNEL试剂盒步骤进行，以胞核呈棕黄色者为阳性。每张切片均在高倍镜(400倍)视野下随机取5个视野，计数凋亡细胞数目及总细胞数目。凋亡指数=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。以5个视野的均值代表每只动物的凋亡指数。
1.5 统计学处理
应用SPSS 11.5软件进行统计学处理。实验所得数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肠黏膜MDA含量和SOD、MPO活性的变化
与I/R组相比，I?post组和IPC组大鼠肠组织MDA含量和MPO活性均显著降低(P<0.01)，而SOD活性则明显升高(P<0.01)；I?post组与IPC组相比，各项指标无显著性差异(表1)。表1 肠黏膜MDA含量及SOD、MPO活性变化（略）
2.2 肠黏膜组织病改变
光镜下，S组肠黏膜绒毛完整，上皮下间隙无扩展，损伤均为0级；I/R组大鼠肠黏膜有多部位不同程度的上皮脱落、黏膜下水肿、毛细血管扩张、瘀血等；I?post组和IPC组病理学改变有所减轻，组织损伤程度评分低于I/R组(P<0.01)。
2.3 肠黏膜细胞凋亡率的变化
S组大鼠肠绒毛顶部、固有层和黏膜下层有极少量散在分布的阳性凋亡细胞(图1A)；I/R组阳性细胞数量明显增加，分布范围从绒毛顶部扩大到中、底部，固有层和黏膜下层细胞凋亡亦明显加重，凋亡率大于S组(P<0.01，图1B)；I?post组和IPC组阳性细胞数量及分布范围则明显少于I/R组(P<0.01，图1C、1D)，I?post组和IPC组相比无统计学意义。
3 讨 论
肠缺血?再灌注损伤发生机制复杂，其中以氧自由基的损伤为最重要的发病环节。研究发现肠缺血?再灌注后肠黏膜细胞以凋亡为主，而氧化损伤是细胞发生凋亡的重要诱因[7]。关于氧自由基诱发细胞凋亡的机制，目前大多认为氧自由基可直接与细胞膜表面不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，也可导致线粒体结构和功能受损，引起线粒体膜电位下降、呼吸链解偶联、细胞色素C和其他促凋亡因子释放。细胞色素C、凋亡蛋白活化因子(Apaf?1)和caspase?9复合物的形成，激活caspase?3，后者启动内在的细胞凋亡级联反应[8]。本实验发现，I/R组大鼠肠黏膜MPO活性和脂质过氧化物终产物MDA含量增加，而抗氧化物酶SOD活性显著降低，表明其保护组织细胞免受毒性氧自由基损伤的效能减弱，过量的氧自由基可直接造成生物膜结构和功能的破坏，触发细胞凋亡的发生。研究表明，在再灌注最初的几分钟内由于突然获得氧的情况将会加速ATP的合成，但同时也加剧了细胞内Ca2+超载和中性粒细胞呼吸爆发，产生大量氧自由基，从而导致再灌注损伤[9]。本实验所采用再灌注前、反复短暂的预再灌注、停灌注的缺血后处理方案，在某种意义上相当于有控制的缓慢间歇性复氧，可减少突然全面复氧时氧自由基的大量产生，并刺激细胞内抗氧化酶和自由基清除剂的释放而发挥保护效应。与I/R组相比，I?post组肠黏膜中MDA含量、MPO活性明显下降，而SOD活性则显著升高，与IPC组无显著性差异，同时肠黏膜细胞凋亡指数亦明显下降。说明缺血后处理在再灌注早期应用可减少再灌注后氧自由基的过度生成并加速其清除，减轻氧自由基对生物膜结构和功能的破坏，阻断氧自由基凋亡途径，从而拮抗肠黏膜细胞凋亡的发生，发挥其抗缺血?再灌注损伤的作用。综上所述，肠缺血?再灌注损伤后大鼠存在明显的肠黏膜损害。再灌注期间氧自由基的过量产生引发肠黏膜细胞凋亡参与了肠缺血?再灌注损伤。缺血后处理能降低氧自由基的产生、中性粒细胞在肠黏膜内的聚集、保护抗氧化系统，从而减轻细胞凋亡和再灌注损伤。采用合理的缺血后处理不仅能实现抗缺血?再灌注损伤作用，而且与缺血预处理相比，具有操作简单、方便、可行的特点，易为外科医生所接受。
【】
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