引阳素胶囊中淫羊藿苷的含量测定

【关键词】  淫羊藿苷；引阳素胶囊；高效液相色谱

　　摘要：目的  建立引阳素胶囊中淫羊藿苷的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法。方法  采用HPLC法。色谱柱Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，C18保护柱；流动相为乙腈20g/L冰醋酸水溶液(30∶70)；检测波长270nm；流速1.0mL/min；柱温为室温；进样量10μL。样品加50%(体积分数)乙醇超声提取，浸提液过0.45μm滤膜后测定。结果  淫羊藿苷线性范围为10.0-60.0mg/L， 回归方程为C=2.042×10-5A+0.554，r=0.9993，平均回收率为99.8%，RSD为0.65%。结论  本法用于引阳素胶囊中淫羊藿苷的含量测定时简便快捷、准确。

　　关键词：淫羊藿苷；引阳素胶囊；高效液相色谱

　　Determination of icariin in Yinyangsu capsules by HPLC

　　ABSTRACT: Objective  To establish an HPLC method for testing the content of icariin in Yinyangsu capsules. Methods  An Lichrospher C18(4.6mm×250mm, 5μm) was used as the column, and column C18 as the protecting column. The mobile phase was a mixture of acetonitrile -20g/L acetum (30∶70) in a flow rate of 1.0mL/min. The detected wavelength was 270nm. Column temperature was room temperature and the injection quantity was 10μL. The sample was prepared when we added 50%(V/V) alcohol and then made ultrasonic extraction. Measurement was made after the prepared sample was filtrated on 0.45μm filter paper. Results  Icariin in the sample was well separated. The linear range was 10.0-60.0mg/L. The linear equation was C=2.042×10-5A+0.554, while the correlation coefficient was 0.9993; the average recovery was 99.8% and RSD was 0.65% (n=6). Conclusion  This method can be used in content measurement of Yinyangsu capsules.

　　KEY WORDS: icariin; Yinyangsu capsule; HPLC

　　引阳素胶囊处方由淫羊藿浸膏和五味子浸膏等组成。具有补肾、壮阳、生津的作用。用于阳萎早泄、腰膝酸软、津亏自汗、头目眩晕等症。方中淫羊藿的有效成分是淫羊藿苷。为了有效控制药品质量, 对制剂中的主要成分淫羊藿苷进行含量测定。

　　1  材料

　　1.1  仪器与试药  日本岛津LC10AT高效液相色谱输液泵，SPD10AVP紫外可见检测仪，岛津7725i进样品，ANASTAR色谱工作站，DL360超声波清洗器(浙江象山县石浦海天仪器厂，功率240W，频率35kHz)，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂为分析纯。淫羊藿苷对照品由药品生物制品鉴定所提供，批号110737200312，供含量测定用。引阳素胶囊由西安阿房宫制药有限公司提供，批号2003050120030503。

　　1.2  标准溶液的配制  精密称取淫羊藿苷对照品，用甲醇溶解并制成每mL含淫羊藿苷0.10mg的对照品溶液，备用。

　　1.3  样品溶液的制备  取试品内容物研细，取0.1g，精密称取，置具塞三角瓶中，加50%(体积分数)乙醇50mL，称其质量，超声提取20min，放冷，再称其质量，用50%(体积分数)乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液测定。

　　1.4  阴性对照溶液的制备  依处方工艺制成不含淫羊藿药材的胶囊，再按1.3方法制成阴性样品溶液。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件  色谱柱Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，C18保护柱；流动相：乙腈20g/L冰醋酸水溶液(30∶70)，使用前经0.45μm微孔滤膜过滤并脱气；检测波长270nm；流速1.0mL/min；柱温为室温；进样量10μL。 在此条件下，对照品、供试品及阴性样品溶液的色谱图见图1。

　　图1  引阳素胶囊的HPLC色谱图（略）

　　Fig.1 HPLC graphs of icariin in Yinyangsu capsules         

　　a: standard; b: sample; c: blank; 1: icariin

　　2.2  线性关系的考察  精密吸取对照品溶液，加50%(体积分数)乙醇制成每mL分别含10、20、30、40、50、60μg的对照品溶液，混匀，分别进样10μL，测定，记录淫阳藿苷峰面积。以峰面积A对对照品的浓度C(mg/L)作图，进行回归分析，得回归方程为：C=2.042×10-5A+0.554，r=0.9993。可见，淫羊藿苷浓度在10-60mg/L范围内与峰面积呈线性关系。

　　2.3  样品溶液的制备方法  实验采用正交实验法对样品浸提体积A(mL)、超声时间B(min)等影响因素进行了考察。因素水平： A1=25、A2=50、A3=75； B1=10、B2=20、B3=40。浸提方法与结果：将同批号样品研细，精密称取0.2000g于100mL具塞三角瓶中，分别按L9(34)正交表进行试验，制得样品后再用50%(体积分数)乙醇稀释使最后的提取液体积均为75mL，按2.1测定，用统计软件SPSS11.0对淫阳藿苷峰面积进行分析处理(表1-表3)。

　　表1  淫羊霍苷的不同浸提方法的正交试验L9(34)结果（略）

　　Table 1  Orthogonal experiment results of lixiviation for icariin

　　表2  淫羊霍苷的不同浸提方法的多因素方差分析（略）

　　Table 2  Multiple factor variance analysis of lixiviation for icariin

　　表3  不同超声时间淫羊藿苷峰面积的方差分析表（略）

　　Table 3  Multiple comparison of different ultrasonic extracting times

　　上述实验结果表明，因素A对实验结果无显著性影响(P>0.05)，因素B有显著性影响(P<0.01)；B1与B2、B3之间有显著性差异(P<0.01)，B2、B3之间无显著性差异(P>0.05)。考虑到实验操作的便易程度等因素，样品最佳浸提工艺为A2B2(见1.3项下)。

　　2.4  精密度试验  按1.3项下制备一份样品，重复进样5次，每次10μL，按2.1色谱条件测定峰面积，结果峰面积积分值RSD<1%, 说明精密度良好。

　　2.5  稳定性试验  按1.3项下制备一份样品，分别于0、2、4、8、24h精密吸取10μL，按2.1色谱条件测定，记录峰面积积分值，结果峰面积积分值 RSD<1%，表明供试品溶液在24h内稳定。

　　2.6  重复性试验  取同批样品5份，依上法测定，含量测定结果RSD<1%。

　　2.7  回收率试验  采用加标回收法，取已知含量的同批样品数粒，倒出内容物，研钵中研细，精密称量6份，分别精密加入淫羊霍苷对照品，依上法测定。结果淫羊霍苷回收率平均值为99.8%，RSD为0.65%，表明回收率良好。

　　2.8  样品测定  按上法分别测定不同生产批号的三批样品，结果三批样品含淫羊藿苷的量在7.562-16.345mg/g之间。

　　3  结论

　　淫羊藿苷可溶于甲醇、乙醇、稀乙醇、正丁醇，微溶于水。其提取方法有用甲醇超声提取溶出后，先以氯仿、氨水除去色素等杂质，再用正丁醇提取，残渣以10%(体积分数)乙醇溶解，用大孔树脂柱再次纯化后测定[1]。也有直接加入70%(体积分数)甲醇，超声处理30min后测定 的报道[2]。本文采用相关[34]的提取方法，样品加50%(体积分数)乙醇超声提取，浸提液过0.45μm滤膜后测定，并采用正交试验L9(34)对样品的浸提方法进行了研究，结果样品加50%(体积分数)乙醇50mL，超声提取20min，取续滤液测定效果较佳。色谱流动相有乙腈水(以磷酸调pH 值)(30∶70)[12]、直接乙腈水(30∶70)[3]及乙腈20g/L乙酸水(30∶70)[4]系统，本文采用乙腈20g/L乙酸水(30∶70)作为流动相，分离度及理论塔板数均达到了要求。

　　文献：

　　[1]卢日刚,唐敏玲，韦向红，等. HPLC 测定肾宝康片中淫羊藿苷的含量 [J]. 中成药, 2004,26(2): 167169.

　　[2]崔俊凤, 傅勇, 耿海霞, 等. RPHPLC法测定益肾灵颗粒中淫羊藿苷的含量 [J].药事，2005,19(9):546547.

　　[3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部) [M]. 北京：化学出版社，2000:267268.

　　[4]张云端，郭长强，张升爱，等. 高效液相色谱法测定益精补肾冲剂中淫羊藿苷的含量 [J].中国药业，2004,13(9):3233.