仿生骨植入钛网管固定修复兔骨缺损
作者：张开放，闫宏伟，刘凯，刘涛
【关键词】 仿生骨；钛网管；骨缺损；修复；兔
摘要：目的 探讨MHAbBMP仿生骨作为替代骨对有限接触式钛网管固定下兔股骨干缺损模型的修复作用。方法 48只新西兰大白兔随机分组，实验组：MHAbBMP仿生骨＋钛网管；对照组：自体髂骨移植＋钛网管。于股骨干中段截除10mm，建立兔股骨干缺损模型，将MHAbBMP仿生骨/自体髂骨植入骨缺损处加有限接触式钛网管固定修复骨缺损。观察兔一般情况，检测血碱性磷酸酶，进行X线片、病理组织、电镜等观察。结果 钛网管组织相容性好，固定稳定有效，两组均修复了骨缺损。两组血碱性磷酸酶、X线片表现、病理组织、电镜检查的数据经统计分析无显著性差异。结论 有限接触式钛网管对植入物和骨缺损断端起到可靠的固定作用；MHAbBMP仿生骨与自体髂骨植入相比较，诱导成骨活性相当。
关键词：仿生骨；钛网管；骨缺损；修复；兔
Bionic bone implantation combined with limited contracted titanium net duct on the repairment of rabbit bone defect
ABSTRACT: Objective To investigate the effect of MHAbBMP implantation combined with limited contacted titanium net duct fixation on femoral shaft bone defect in rabbits. Methods A total of 48 rabbits were divided into experimental group (treated with bionic bone MHAbBMP plus titanium net duct ) and control group(treated with iliac autograft plus titanium net duct). The rabbit femoral shaft bone defect model was established by cutting 10mm bone fragment off. After operation, bionic bone MHAbBMP/iliac autograft was implanted into the bone defect area and fixed with limited contacted titanium net duct. The general condition, serum alkaline phosphates, Xray, histopathologic and electron microscopic examinations were performed. Results The fixation stability of titanium net duct in the two groups was good. The bone defect in the two groups was repaired. The phosphates, Xray, histopathologic and electron microscopic examinations in the two groups were not significantly different. Conclusion The limited contacted titanium net duct can provide a reliable fixation effect on the graft and bone defect ends. Induction bone formation activity of MHAbBMP is comparable to the iliac autograft.
KEY WORDS: bionic bone; titanium net duct; bone defect; repair; rabbit
负重骨缺损是骨科临床的常见病，其病程长，自愈率低且致残率高。因而是近年来研究的热点和难点之一。负重骨缺损主要难点在于：作为负重骨缺损时主要填充的材料之一的自体骨来源有限，尤其是大段骨缺损患者；目前市售的骨替代产品品种较多，但具有良好的骨传导性、诱导成骨性、良好的组织相容性和适当的可降解性的罕见；负重骨缺损时骨替代物难以获得稳固的固定，造成填充物骨断端界面间不稳定而影响新生骨组织的长入和断端间的骨性连接过程；目前临床上常见的基于国际内固定研究协会理论设计的内固定材料虽具有固定牢靠的特点，但同时对软组织损伤大，需要进行骨膜下剥离，对骨折血运干扰较大，弹性模量较大而产生应力遮挡效应等不足之处。本课题通过有限接触式钛网管加MHAbBMP仿生骨修复兔股骨干骨缺损的实验研究，获得较理想的内固定材料和一种高效生物活性替代骨。
1 材料与方法
1.1 材料 ①钛网管：为宝鸡钛金属公司生产的03号医用纯钛金属，出厂测试弹性模量为80GPa，钛胚为厚度1.1mm冷轧钛板。制成凸刺面朝内，光面朝外，弯制成不完全合抱的圆柱体，钛网管长33mm，直径6.0-7.0mm，孔密度8个/cm2，凸刺高约0.5mm。植入时可根据需要做较大幅度的加工塑型。同时加工若干直径为1.1mm，长5cm的钛针，以配合钛网管固定时使用。②牛骨形态形成蛋白(bull bone morphogenetic protein, bBMP)：由第四军医大学骨科研究中心生产，总量≥240mg。③多孔羟基磷灰石(multihole hydroxyapatite, MHA)：由西安大学化工学院研制。规格：柱状Φ＝7mm，h＝12mm，孔径Φ＝200-300μm，孔率≥50%。
1.2 MHAbBMP仿生骨的制备 将bBMP溶解于3mol/L的稀盐酸溶液中充分溶解后，将多孔羟基磷灰石(MHA)颗粒放入溶液中，进行负压抽吸，压力为0.07个大气压(7.09kPa)，每次15min，反复3次，将所有溶液抽干。脱酸，透析后低温冻干，钴60照射消毒1h。即制成MHAbBMP仿生骨，每粒仿生骨Φ＝7mm，h＝12mm，含bBMP≥10mg。
1.3 实验分组及动物造模 ① 选用健康新西兰大白兔48只(购自西安交通大学实验动物中心)，雄性，6月龄，体重(3.0±0.2)kg。随机分为两组：钛网管加自体髂骨为对照组；钛网管加MHAbBMP仿生骨为实验组，每组24只，并随机编号A1-A24，B1-B24。②实验动物造模：制备20g/L硫喷妥钠溶液作为麻醉剂，按照2mL/kg体重给予耳缘静脉注射全身麻醉。麻醉起效后，取俯卧位，兔左后肢备皮，常规消毒铺巾。于兔左股部中段外侧纵行切开3-4cm，沿股四头肌外侧与股后肌群间隙进入，钝性分离肌组织和周围软组织，显露股骨骨干，不进行骨膜下剥离，于股骨中段用钢锯造成10mm(为兔股骨干直径的1.5倍左右)之骨质缺损，成兔骨缺损模型，分别为钛网管加自体髂骨和钛网管加MHAbBMP仿生骨，然后关闭切口，不作任何内外固定。术后肌注青霉素每公斤体重2万单位，连续7d。
1.4 一般情况的观察 术后饮食活动情况，伤口有无感染、肿胀及分泌物等。
1.5 血清学检查 血碱性磷酸酶含量测定，术后1-8周，每周1次，共8个时间点。
1.6 X线片的观察 术后1、2、4、6、8、12周，共6个时间点。
1.7 病理和组织学检查 术后1、2、4、6、8、12周，共6个时间点进行大体标本、组织学和光镜脱钙标本、光镜不脱钙标本观察。包括低10×10倍镜，高10×40倍镜观察，观察项目包括植入物的表面情况、白细胞浸润情况、新生毛细血管、成骨细胞、破骨细胞的形态、分布和计数，新生骨小梁形态、面积以及外骨痂等内容。
1.8 扫描电镜标本的观察 主要观察骨小梁的超微结构，骨细胞和成骨细胞的数量、形态和超微结构，细胞器是否正常，局部胶原纤维生成情况等。
1.9 统计学处理 应用SPSS 11.0 统计学软件进行t检验，数据以±s表示，采用χ2检验，P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况 术后实验动物的进食饮水、大小便情况良好，均在2d内恢复走动，步态无明显异常。患肢肿胀在一周内基本消退，直到处死前均未见畸形发生。伤口局部无红肿、硬结、渗出和其他感染迹象。
2.2 血清碱性磷酸酶 实验组和对照组在术后两周均出现血清碱性磷酸酶高峰值，维持约4周后逐步下降，两组数据在统计学上无显著性差异(P>0.05，表1)。
表1 血清碱性磷酸酶浓度的均数测定结果（略）
Table 1 The concentration of the serum alkaline phosphatase
2.3 两组的X线片观察 在6个时间点上X线片显示：实验组和对照组均股骨复位满意，股骨干力线良好，无侧方移位、成角、分离等畸形，钛网管无移位或松动迹象。两组从第1周的未见明显骨痂形成到第2周少量骨痂生成，随着时间变化骨痂逐渐增多，到第12周大量骨痂形成，大部分区域有连续性骨痂生成，两断端连接，并包裹钛网管。两组在复位效果、固定效果和骨痂形成等方面没有明显差异(图1)。
2.4 大体标本与病理组织的观察 大体标本：对照组和实验组均在第1周时未见有明显骨痂形成。断端间的仿生骨或自体髂骨与股骨断端间有少量连接。仿生骨表面有少量软组织长入。2-4周后，有较多的外骨痂形成。外骨痂可以经过钛网管的孔与股骨干和仿生骨(自体髂骨)表面相连接，而且随着外骨痂量的增多和不断地钙化，这种连接越来越紧密稳固，到12周左右这种连接已经使钛网管和外骨痂及股骨干成为一个统一的整体，需要借助咬骨钳才能将外骨痂和钛网管完全分离开。钛网管应用不干扰外骨痂形成。MHAbBMP仿生骨和自体髂骨植入后均可以起到诱导新生骨组织长入，连接断端的作用。组织学观察：统计数据表明实验组与对照组在成骨细胞数量、破骨细胞数量、新生骨面积方面均无显著性差异(P>0.05,表2)。电镜观察：实验组2、4、6周标本显示，MHAbBMP仿生骨植入后，细胞微观基本正常，没有引起明显的细胞损伤(图2)。
图1 两组的X线片（略）
Fig.1 Xray pictures of the two groups
A: Osteotylus of experimental group began to cover titanium net duct at sixth week; B: Osteotylus of control group began to cover titanium net duct at sixth week; C: Osteotylus of experiment group cover titanium net duct completely at twelfth week; D: Osteotylus of control group cover titanium net duct completely at twelfth week
表2 两组的成骨细胞数量、破骨细胞数量和新生骨面积（略）
Table 2 The examination of osteoblast, osteoclast and ossification area
图2 病和电镜照片（略）
Fig.2 The pictures of histopathologic and electron microscopic examinations
A: gap fillerbroken ends of fractured bone of experimental group at fourth week; B: gap fillerbroken ends of fractured bone of control group at fourth week; C: membrane bone formation and osteoblast of experimental at fourth week; D: membrane bone formation and osteoblast of control at fourth week; E: trichrome stain of experiment group at sixth week. The red is newly formed bone; F: trichrome stain of control group at sixth week. The red is newly formed bone.
3 讨论
骨缺损是指由于各种原因导致局部骨质缺失大于等于骨干本身直径1-2倍者，人体不能自行修复。可由创伤、骨髓炎、骨结核、骨肿瘤以及多种遗传代谢性疾病引起，是骨科领域的常见病。其病程长，自愈性低，致残率高。目前，其方法虽然较多，但疗效可靠者不多。造成上述情况的主要原因有以下几个方面：①主要原因在于大量的骨组织缺损后，不能进行端对端复位并且获得有效固定，即使填充植入物，植入物本身尚不能提供牢靠地早期界面间的固定，而且也不能充分对抗轴向压应力。沿用AO系列钢板内固定，其特殊的螺钉螺钉加压结构导致轴向加压力量太强大，完全可以损毁植入物的物理结构，且手术损伤大，植入后的近期和远期对局部血运干扰较大，刚性较强而造成应力遮挡或远期的疲劳断裂[1]。所以，要提高疗效，需借助更合理的内固定材料的应用来完成界面间的稳定作用[2]。②有学者提出，骨折愈合是建立在非特异反应基础上的特异性识别过程。骨缺损造成的间隙，如果被异物、软组织等填充或间隔，将造成特异性修复过程在起始阶段发生“识别障碍”，从而中断修复过程，不能特异性地产生新生骨组织，往往表现为断端间有纤维组织形成。这就要求植入的填充材料从理化性质、生物学特性、免疫原性和抗原性等多方面尽量接近或等同于骨组织，从而保证特异性修复过程的顺利开始直至完成。③大量骨组织缺损后，在断端间隙的局部造成较大的细胞和生物活性因子缺乏区域，即成骨所需的“物质浓度”大幅下降，不足以胜任诱导新生骨组织的任务，需要额外的补充。这就要求植入物是要能够提供或补充一部分具有生物活性物质的材料[23] 。 ④羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)是人体骨骼无机质成分的主要存在形式。人体内骨骼的矿物质主要由无定形的磷酸钙和结晶状HA组成，精细结晶状HA[CaO(PO4)6(OH)2]约占70%，呈六角形晶体结构[45]。为了获得满意的试验结果和临床疗效，研制骨替代材料时要使所制备的材料的化学成分尽可能与人体骨组织的特性相似。目前研究最多的是钙磷比1.7左右的纯多孔羟基磷灰石[67]。当MHA的孔径在150-500μm时具有良好骨传导性[89]、组织相容性[5]、生物结合活性[10]、骨诱导性和可降解性[1112]。骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是在1965年由Urist发现的一种低分子酸性多肽。具有可诱导血管周围游动间充质细胞转化为不可逆性骨系细胞，从而可以在骨组织和骨骼以外组织部位产生软骨和骨组织。有关研究证实人和其他动物的BMP有高度同源性，能跨越种属交叉诱导成骨。Takeda等通过对人和鼠BMPIA受体cDNA的氨基酸密码分析，发现两者同源性高达97%。当前实验和临床均使用bBMP。 有关研究显示就现阶段来说，纯钛金属与人体组织有良好组织相容性。本课题选用的宝鸡钛金属公司生产的03号医用纯钛金属较为接近人体组织的弹性模量(60-120GPa)。本课题利用MHA良好的骨传导性、组织相容性、生物结合活性、骨诱导性和可降解性，与bBMP高度同源性和强力骨诱导活性制成的MHAbBMP仿生骨作为具有生物活性的替代骨，在有限接触式钛网管固定下修复了兔股骨干骨缺损模型。通过实验研究，可以得出以下结论：①有限接触式钛网管联合MHAbBMP仿生骨植入能有效修复兔股骨干骨缺损模型；②钛网管固定对外骨痂的形成无不良反应；③有限接触式钛网管对植入物和骨缺损断端起到可靠的固定作用，保证了新生骨组织长入仿生骨并将断端骨性连接；④MHAbBMP仿生骨与自体髂骨植入组相比较，诱导成骨活性相当。
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