一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用
【关键词】 质粒DNA；提取；酶切；转染
摘要：目的 建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法，探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法 将含有目的质粒的菌株扩增后，运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取，微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度；采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果 改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2mg/L菌液，A260/280=1.91；内切酶酶切完全；质粒DNA以超螺旋结构为主；真核细胞转染效率为20%左右。结论 改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用，获得质粒DNA产量多、质量高，能达到分子生物学常规实验的要求。
关键词：质粒DNA；提取；酶切；转染
An improved and economical method for isolation of plasmid DNA
ABSTRACT: Objective To explore a simple, improved and inexpensive method for isolation of plasmid DNA and its value in molecular biological laboratory research. Methods Plasmid DNA was isolated using general alkaline lysis method and improved method, respectively. The isolated plasmid DNA was quantified by spectrophotometric measurement, and evaluated by the electrophoresis of plasmid DNA in an agarose gel, the restriction enzyme digestion, and the transfection into eukaryotic cells. Results The quantity of plasmid DNA isolated by the improved method was 3.2μg per milliliter culture of transformed bacteria, and the ratio of A260/280 was 1.91. The plasmid DNA could be fully digested by restriction enzyme. The efficiency of the plasmid DNA transfection into eukaryotic cells by Lipofectamine2000 was about 20%. Conclusion The improved method is simple, practical and economical. Plasmid DNA isolated by this method has been shown to be suitable for restriction enzyme digestion and cell transfection.
KEY WORDS: plasmid DNA; isolation; restriction enzyme digestion; transfection
质粒DNA是生物学实验中常用的载体工具，在基因工程领域应用非常广泛。质粒DNA的提取已成为分子生物学实验中的一种常规方法。在“碱裂解法”[1]的基础上进行优化改进，形成了一系列的质粒DNA提取方法[2]，并生产出一系列商品化提取试剂盒[3]。用经典“碱裂解法”少量提取质粒能获得高质量的质粒DNA，但在提取过程中，碱裂解不完全或裂解过度、蛋白质污染以及酚氯仿的残留都能影响进一步的分子生物学实验效果。我们研究所在“碱裂解法”的基础上进行了优化、改进，尝试了一种实用的改良式质粒DNA提取方法，经反复实践验证，该方法比较稳定、可靠，能获得转染级别的质粒DNA。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株及培养液 含有绿色荧光蛋白报告基因(enhanced green fluorescence protein, EGFP)真核表达质粒载体pEGFPN1(质粒DNA全长4.9kb)购自Clontech公司；转化菌Ecoli.DH5a由本研究所保存。LB培养液(蛋白胨、酵母提取物、氯化钠)。
1.1.2 内切酶及细胞转染试剂 内切酶BamHⅠ购自TaKaRa公司；脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。
1.1.3 试剂及配制 ①溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L TrisHCl，10mmol/L EDTA，pH8.0；溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，10g/L SDS；溶液Ⅲ：3mol/L乙酸钾，pH 5.5。②Tris饱和酚/氯仿/异戊醇按24∶24∶1体积比配制成混合液。③异丙醇，70%(体积分数)无水乙醇。④RTE溶液：10mmol/L TrisHCl (pH 8.0)，1mmol/L EDTA+0.1g/L RNase A(无DNase)。以上试剂均为国产分析纯。
1.1.3 国产针式滤器 直径35mm可反复使用针式小滤器及0.22μm滤膜购自华美生物公司。1mL、5mL注射器为BD公司产品。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA提取的操作步骤 经典质粒DNA“碱裂解法”小提取方法按照第三版分子克隆指南[1]步骤进行。改良式质粒DNA提取具体方案如下：①取1.5mL菌液，8000g/min离心5min，吸净上清；②240μL 溶液Ⅰ重悬，8000g/min离心5min，吸净上清，重复该步骤1次；③240μL 溶液Ⅱ碱裂解，迅速轻柔翻转6次，静止4-5min；④240μL溶液Ⅲ中和、沉淀，迅速轻柔翻转6次，冰上静止15min，4℃ 12000g/min离心10min；⑤1mL胰岛素注射器吸取上清，尽量减少吸入蛋白质沉淀层(提取多管时可以用5mL注射器吸取)；⑥上清经国产0.22μm针式滤器(图1)过滤入1.5mL Ependorf管内；⑦加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30min，4℃ 12000g/min离心30min，吸净上清；⑧70%(体积分数)乙醇0.5mL洗涤沉淀，4℃ 12000g/min离心10min，重复该步骤1次；⑨吸净上清，室温干燥，出现沉淀边缘透明为止；⑩20μL RTE(含0.1g/L RNase A)溶解沉淀，37℃水浴箱孵育1-3h，彻底降解残余RNA。电泳、酶切鉴定及细胞转染。
图1 质粒DNA提取中使用的滤器（略）
Fig.1 The filter used in “improved and economical method” which contained a 5mL syringe (BD Co.) and a 0.22μm needle filter
1.2.2 提取质粒DNA定量 用微量核酸测定仪进行质粒DNA含量和纯度测定。
1.2.3 酶切电泳 按BamHⅠ内切酶说明书进行酶切反应(37℃, 1h)。酶切产物10μL，10g/L琼脂糖凝胶电泳。
1.2.4 提取质粒转染Hela细胞 将改良方法提取的pEGFPN1质粒，参照Lipofectamin2000说明转染人宫颈癌Hela细胞株，转染48h后荧光倒置显微镜(Olympus IX50, Japan)下观察。
2 结果
2.1 提取质粒DNA定量 运用改良式提取方法1L菌液能获得3.2mg质粒DNA，A260/280=1.91。
2.2 酶切电泳 经BamHⅠ单酶切能获得4.9kb线性目的片断(图2B)。经典“碱裂解法”提取质粒DNA可以见到降解的质粒DNA条带(图2A中箭头所示)。
图2 两种不同提取方法提取的质粒DNA酶切电泳图的比较（略）
Fig.2 Electrophoresis of plasmid DNA isolated using “general alkaline lysis method” and “improved method”
A: The plasmid DNA without restriction digestion; Band 1: plasmid DNA isolated using "general alkaline lysis method"; Band 2: plasmid DNA isolated using "improved method". There was a degradation band in band 1, as shown with the arrow; M: DNA marker; B: Results of plasmid DNA isolated using "improved method" digestion with restriction endonucleases BamHⅠ; Band 1: 4.9kb lined fragment; Band 2: plasmid DNA without restriction digestion; M: DNA marker
2.3 Hela细胞的转染 转染48h后可以见到绿色荧光蛋白表达的细胞，48h绿色荧光最强，可以持续5d左右，转染效率在20%左右(图3)。
图3 改良式质粒DNA提取方法获得质粒pEGFPN1转染的Hela细胞 (48h)（略）
Fig.3 Transfection into HeLa cells with the plasmid DNA isolated by an improved and economical method. Expression of GFP was visualized with an inverted fluoroscence microscope (Olympus IX50, Japan) and photographs were taken at 48h after transfection
A: Illumination with visible light; B: Green fluorescence of the transfectants
3 讨论
经典“碱裂解法”少量提取方法能获得高质量的质粒DNA，但在提取过程中，溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量的比例要求严格，以免裂解不完全或裂解过度。碱裂解不完全容易产生细菌基因组DNA和蛋白质污染；裂解过度则使得超螺旋结构的质粒DNA减少，并且易产生降解的质粒DNA片断[4]。酚氯仿的使用可以抽提残余蛋白质，但是容易残留于含有质粒DNA的上清中，导致内切酶不能顺利酶切，且酚氯仿是有机溶剂，对人体有一定的危害。我们在经典“碱裂解法”的基础上进行了优化改进，可以获得质量较高的质粒DNA。改进点如下：①溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的比例优化：提取1.5mL菌液时，溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ比例为(μL)240∶240∶240。经反复实验我们发现，与经典的100∶200∶150比例相比，优化后的比例使得菌体裂解更充分，蛋白质和基因组DNA沉淀更彻底，并且不易产生降解的质粒DNA。 ②溶液Ⅰ洗涤沉淀2次，可以将细菌培养液较彻底的去除，有利于减少提取质粒DNA中的内毒素含量。③针式滤器过滤上清：获取质粒DNA上清液时容易有少量蛋白质沉淀吸入，经典方法用“酚氯仿”再次抽提，我们用国产0.22μm针式滤器过滤上清，可以将吸入的少量蛋白质去除，达到进一步纯化目的。④异丙醇沉淀质粒DNA：使得质粒DNA沉淀较充分。含有RNase A的TE溶液中，37℃水浴数小时以保证RNA充分降解，避免下一步实验中RNA的干扰。本方法提取质粒DNA纯度可以达到A260/280=1.91，琼脂糖凝胶电泳结果显示没有降解质粒DNA条带，质粒以超螺旋结构为主。提取质粒常规Lipofectamine2000转染Hela细胞效率能达到20%左右，能筛选出稳定表达EGFP阳性细胞克隆。改良式提取方法中使用的试剂均为国产分析纯，价格低廉，与质粒抽提试剂盒相比，成本较低，又能获得同样的效果，能满足基本的分子生物实验。
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[1]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual [M]. 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001:1619.
[2]Fan CF, Mei XG. A simple, efficient, and economical method for recovering DNA from agarose gel [J]. Prep Biochem Biotechnol, 2005, 35(1):7178.
[3]King CH, Plikaytis BB, Shinnick TM. Isolation of plasmid DNA from mycobacteria using a resinbased alkaline lysis kit [J]. Biotechniques, 1995, 19(3):326330.
[4]Sayers JR, Evans D, Thomson JB. Identification and eradication of a denatured DNA isolated during alkaline lysisbased plasmid purification procedures [J]. Anal Biochem, 1996,241(2):186189.
