造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的影响

                     作者：张乃红， 冯玫， 鹿育晋 朱镭， 刘洁， 高鸿鹏， 李为民， 乔振华

【摘要】  本研究探讨造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞天然免疫黏附功能及红细胞对NK细胞杀伤活性的影响。外周血枸橼酸钠抗凝，检测红细胞在自身血浆条件下对K562细胞的免疫黏附并黏附率。用MTT法测定红细胞对正常NK细胞杀伤K562细胞活性的影响，并与未加红细胞时进行比较。结果表明：红细胞对K562细胞形成了"玫瑰花"样结合。正常人红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为（15.3±6.4）%，造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为（7.6±7.0）%，与正常人相比较显著下降（t=3.61, p﹤0.001）。不加红细胞条件下，正常人外周静脉血NK细胞杀伤K562细胞活性为67%-71%。正常人红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性杀伤率为（14.7±5.2）%，造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低NK细胞杀伤K562细胞活性，杀伤率为（4.3±7.6）%，二者比较有显著差异（t=6.73， p﹤0.0001）。结论：造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附能力下降，正常人红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性，而造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低NK细胞杀伤K562细胞活性，原因需进一步研究。

【关键词】  造血组织肿瘤

    Erythrocyte Native Immune Adhering Function (ENIAF)  in Patients with Hematopoietic and Lymphoid Neoplasms  and Its  Effect  on NK Cell Killing Activity

       Abstract    The objective of  this study was to investigate  the change of native immune adhering function (ENIAF) in    self?plasma of patients with hematologic and lymphoid neoplasms and its effect on the killing activity of NK cells. The whole blood was anticoagulated with citric acid. 5 μl precipitated red blood cells and 500 μl plasma of patients or controls were directly mixed with 750 μl  quantitative K562 cells at 37℃ for 30 minutes. One K562 cell attached by one or more erythrocytes was counted as one rosette,   the ratio of rosettes was calculated. Using K562 cells as target cells,  the killing activity of NK cells isolated from normol persons was detected by MTT assay,  the change of the killing activity was observed after adding RBCs. The results indicated that the  ratio of rosettes formed by RBCs of 21 normal controls and K562 cells was 15.3%±6.4%, and the ratio of rosetfes formed by RBCs of 24 patients and K562 cells  was 7.6%±7.0%. The ability of ENIAF in patients with hematologic and lymphoid neoplasms was significantly lower than that in healthy individuals （t=3.61, p﹤0.001）. The killing rate of NK cells in peripheral blood of normal individuols  was 67%-71% without adding RBCs, and it increased by 14.7%±5.2% after adding RBCs of normal controls but decreased by 4.3%±7.6% with RBCs of patients. It is concluded that   the ENIAF of RBCs in patients with hematopoietic and lymphoid neoplasms decreases, accompanying  the reduction of the killing activity of NK cells to K562 cells, so to detect  change of ENIAF may be helpful for  the assessment of the immunological function of patients with hematopoietic and lymphoid neoplasms.

    Key words    hematopoietic neoplasm;  lymphoid neoplasms; erythrocyte; innate immune adhering function; NK cell

    红细胞作为天然免疫的一个重要的构成部分，是机体免疫平衡和稳定的重要基础［1］。红细胞能够结合、固定、聚集免疫复合物或微生物，将其呈递给吞噬细胞［2，3］，使吞噬细胞的吞噬作用增强4-6倍。红细胞具有免疫调节作用，能够增强T细胞依赖的免疫应答，调节B细胞的活化及Ig的产生，调节补体的活化过程，还能促进NK细胞的杀伤作用。研究表明，NK细胞直接介入控制AML的复发；把NK细胞植入NOD/SCID小鼠排斥了植入的AML细胞，这也证明NK细胞对移植的AML有异体反应性。红细胞的NK细胞增强因子（natural killer cell enhancing factor， NKEF）是抗氧化剂家族的重要成员，它存在于红细胞质内，能够显著增强NK细胞对K562杀伤活性。

    造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的影响王海滨等［4］建立了红细胞天然免疫黏附功能的快速检测方法。该方法操作简单、重复性高和稳定性好。我们应用此方法研究了造血和淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562 细胞的天然免疫黏附功能，用MTT法测定了造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对正常人来源的NK细胞杀伤K562细胞活性的影响。

    材料和方法

    病例来源

    造血与淋巴组织肿瘤患者来源于山西省人民或山西医科大学第二附属医院血液科门诊及住院患者，正常对照者为门诊体检的健康人，年龄、性别构成一致，具有可比性。患者24例，男性15例，女性9例，年龄19-57岁，其中CML 3例，AML  10例（M3 6例，M4 2例，M5 2例），MDS 1例，ALL 7例，MM    2例，NHL1例。正常对照21例，男性13例，女性8例，年龄18-48岁。患者血标本采集时间为初诊或化疗3周以后，以避免药物对检测结果的影响。

    主要仪器

    CO2培养箱（Heraeus and LISHEN公司生产），培养瓶（50 ml），超净工作台，自动双重纯水蒸馏器（苏州净化设备厂生产），高速离心机(centrifuge 5810R型)，水浴锅，可调微量加样器、微量滴头，普通、倒置显微镜（Olympas），骨髓图象分析仪(天津），细胞记数板，40孔酶标板，流式细胞仪（Conlter公司产品），酶标仪分光光度计（北京六一仪器产品）。

    主要试剂

    1640培养基购自晶美公司，10%胎牛血清，戊二醛，姬姆萨染液。淋巴细胞分离液（Ficoll液），磷酸缓冲液（PBS）， MTT粉末、DMSO购自晶美公司。

    K562细胞培养

    K562细胞购自院细胞库（上海），放于1640培养液中、在37℃、5% CO2条件下培养。于倒置显微镜下观察K562细胞生长情况。根据细胞密度每36-48小时半量换液次。

    红细胞天然免疫黏附功能检测

    由肘静脉取全血2 ml，枸橼酸钠抗凝， 1 500 rpm离心5分钟。取500  μl病人血浆和5 μl沉淀的红细胞，直接加到750 μl新鲜配制的定量靶细胞K562 细胞（浓度为105/ml）悬液中，混匀。37℃，水浴30 分钟。加1 ml固定缓冲液(0.25 %戊二醛)，轻轻混匀，5分钟后阅片。阅片要求：取混匀液150 μl加50 μl姬姆萨氏染液，悬浮涂片(玻片的2 /3)。取4个角和中心5区阅片，每区阅读20个靶细胞，结合上红细胞（1个以上）的靶细胞为1个结合单位，计数100个靶细胞，计算黏附率（每例标本重复2次，结果取平均值）：

    红细胞黏附率(%) = ［黏附1个以上红细胞的靶细胞数 / 5区阅读的共100个靶细胞］×100%

    按常规方法分离效应细胞（外周血单个核细胞PBMNC），流式细胞仪检测其CD3-（CD16CD56）+ 细胞即NK细胞的表达（由流式细胞仪直接给出PBMNC中NK细胞的百分率）。

    杀伤活性测定（最佳细胞密度、效/靶比及反应时间由预实验得到）

    以对数生长期Ｋ562细胞为靶细胞，调整细胞密度为4×105/ ml。以外周血单个核细胞为效应细胞，用RPMI  1640培养液调整细胞密度为4×106/ ml，效/靶比为10∶1，同时设靶细胞孔、效应细胞孔和RPMI  1640空白对照孔。上述各孔均设3个复孔。效应细胞、靶细胞、RPMI 1640孔各为50微升/孔（反应孔），效应细胞孔、靶细胞对照孔各为50微升/孔，RPMI 1640孔为100微升/孔加入40孔板；另设1孔加RPMI 1640培养液150微升/孔为调零点。充分混匀， 37℃、5% CO2培养4小时 。每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)，继续孵育4小时（以上都在超净操作台操作）。弃上清，每孔加DMSO 150 μl，充分吹打、混匀，10分钟内用酶标仪检测570 nm波长OD值，按下述公式计算杀伤率。

    ＮＫ细胞杀伤率(%)=［1 - (实验孔OD值- 效应细胞孔OD值) / 靶细胞孔OD值］×100%

    红细胞对NK细胞杀伤活性的影响

    红细胞的制备  健康人、造血与淋巴组织肿瘤患者的EDTA抗凝新鲜全血（采集6小时之内使用），经淋巴细胞分离液（Ficoll）分离得到红细胞，用生理盐水洗涤2次。

    红细胞的浓度  用RPMI 1640培养液调整细胞密度为4×106/ ml备用。红∶效=1∶1。红细胞与效应细胞一起放入靶细胞，加入后进行培养，即进行杀伤实验。以下步骤同 。

    统计学处理

    结果用SPSS 11.0软件进行统计后分析，行独立样本检测 （independent?sample T Test）。数据以均数±标准差（±SD）表示； p<0.05，差异有显著性。

    结    果

    枸橼酸钠抗凝，在自身血浆条件下红细胞对K562细胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"样结合（图1、2）。21例正常对照外周血红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为（15.3±6.4）%，24例造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为（7.6±7.0）%（表1），与正常人相比显著下降（t=3.61， p﹤0.001）。

    从6名正常对照者外周静脉血分离外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测PBMNC的CD3-（CD16CD56）+ 细胞即NK细胞，结果显示NK细胞占PBMNC的比例为7%-30%（图3），能够满足杀伤活性检测需要。

    Figure 3. Expression level of PBMNC CD3+(CD16CD56)+ cells (NK cells) detected by FCM.

    不加红细胞条件下，用MTT法测得6名正常人来源的NK细胞杀伤K562细胞活性为67%-71%。检测标本时每次设立不加红细胞的对照，加入红细胞后测得的结果减去对照，即得到红细胞增加或减少NK细胞杀伤K562细胞活性的百分率。结果表明，21名正常对照者的红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性，杀伤率为（14.7±5.2）%，而24例造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞明显地减低NK细胞杀伤K562细胞活性，杀伤率为（-4.3±7.6）%（表2），二者比较有显著差异（t=6.73， p﹤0.0001）。

     讨    论

    在外周血中，抗原及肿瘤细胞遇到红细胞的机会比白细胞大1000倍，结合有抗体或补体的肿瘤细胞可通过C3b受体黏附到红细胞上，易被吞噬细胞捕获、吞噬［1］。Craig等［2］通过体外用双特异性单克隆抗体反应剂连接免疫复合物到红细胞上的模型系统，揭示了免疫复合物绞链红细胞到巨噬细胞的中间转移过程。Hament等［3］用流式细胞仪分析表明，在人血清存在下肺炎球菌能结合到人红细胞上，红细胞上的配体为补体受体1（CR1）。国内郭峰［4］提出了"红细胞天然免疫主干道理论"并进行了实验研究［4，5］，他们认为，各种致病性抗原进入血循环首先旁路激活血浆中的补体等可溶性免疫分子，黏附上补体C3b等免疫分子后绝大多数被数量巨大的红细胞补体受体免疫黏附处理，此后交给各种白细胞，激发一系列天然免疫与适应性免疫反应，最终将入侵的致病原消除。

    王海滨等［6］建立了红细胞天然免疫黏附功能（ENIAF）的快速检测方法，在对SARS的研究中获得了许多原创性的成果。他们发现确诊为SARS的病人在收住院1周内其红细胞天然免疫黏附功能即不同程度地下降，并且随病情的加重持续降低，随病情好转开始回升，SARS患者的红细胞CR1数量下降，与ENIAF的变化密切相关，作者认为ENIAF可作为临床动态观察SARS病情变化、疗效评估及预后判断的重要指标［7］。

    对造血与淋巴组织肿瘤患者，我们用红白血病细胞株K562细胞作为靶细胞，外周血枸橼酸钠抗凝，在自身血浆中研究患者的红细胞对K562细胞ENIAF的变化。结果表明，红细胞在自身血浆条件下对K562细胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"样结合，患者红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为（7.6±7.0）%，与正常人的（15.3±6.4）%相比显著下降（t = 3.61， p﹤0.001）。其他肿瘤患者红细胞的黏附功能与正常人的相比也明显低下［8］。

    ENIAF的变化与血沉、淋巴细胞绝对值的变化显著相关, 与合并糖尿病、慢性肝炎也有关系［9］。自身免疫性肝病患者红细胞免疫黏附活性显著低于正常人群（p﹤0.01），并且与自身抗体的升高、病情严重程度密切相关［10］。造血与淋巴组织肿瘤患者中ENIAF变化的原因与意义，尚需要进一步研究。

    NK细胞杀伤活性检测多用敏感细胞株如K562细胞，方法有MTT比色法、LDH释放法、3H?TdR参入法等。崔晓明等［11］研究结果表明，K562细胞数在（1-4）×104/孔时线性关系较好，效、靶作用的时间定为2小时，加MTT后再作用4小时，效、靶比选择5∶1、10∶1结果较理想。王琦等［12］对MTT比色法进行了改良，同时证明MTT比色法与3H?TdR掺入法有高度的相关性（r = 0.96， p<0.01）。

    我们采用MTT法测定NK细胞杀伤K562细胞的活性，发现不加红细胞条件下，杀伤活性为67%-71%，与上面的结果一致。正常人红细胞能使NK细胞杀伤K562细胞活性的百分率明显增加（14.7±5.2）%，造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞却使NK细胞杀伤K562细胞活性明显降低（?4.3±7.6）%，其原因需要进一步研究。对破坏的红细胞刘希英等［13］作了探讨，他们制备红细胞胞质液，观察红细胞胞质液对NK细胞杀伤活性的影响。发现恶性肿瘤病人NK细胞活性明显低于正常对照组（F= 12.85， q = 7.86， p<0.01）；正常人红细胞胞质液可以显著提高自身及病人NK细胞活性（F= 4.32-5.89， q = 3.96-4.49， p<0.05、0.01）。

    在造血系统，许多证据提示NK细胞参与抗白血病免疫反应［14］，NK细胞数量或活性与急性白血病的预后之间存在负相关，NK细胞活性依赖性的免疫缺陷综合征与淋巴、造血系统肿瘤发生率升高有关，NK细胞在异基因骨髓移植中的GVL效应中起重要作用。Miller等［15］对NK细胞抗白血病的作用进行了研究，结果显示在较强的免疫抑制方案（Hi?Cy/Flu）后输注NK细胞造成了内源性IL?15的明显上升及供体NK细胞的扩增，并且在19例预后不佳的AML患者中5例产生了完全血液学缓解。

    所以，红细胞可能影响NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性。进一步研究造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞免疫与NK细胞免疫、DC功能、T、B细胞免疫等之间的关系，对于揭示其发病机制、发展更全面的治疗策略可能具有重要的意义。

【参考】
  1郭峰，钱宝华，张乐之主编. 红细胞免疫学. 上海：上海第二军医大学出版社. 2002：40

2Craig ML, Bankovich AJ, Taylor RP. Visualization of the transfer reaction: tracking immune complexes from erythrocyte complement receptor 1 to macrophages. Clin Immunol, 2002； 105:36-47

3Hament JM, Van?Dijk H, Fleer A, et al. Pneumococcal immune adherence to human erythrocytes. Eur J Clin Invest, 2003； 33:169-175

4王海滨，张景萍，郭峰等. 红细胞天然免疫粘附肿瘤细胞的现象及意义. 中华微生物学和免疫学杂志，2001； 21：263-266

5王海滨，曾珍，鞠连才等. 评估SARS病情发展快速检测方法的建立及应用. 中华微生物学和免疫学杂志，2003; 23：572-574

6王海滨，姜平，曾珍，等。红细胞天然免疫黏附功能检测在评估传染性非典型肺炎(SARS)病情发展中的应用. 中华医学杂志，2004;84：27-28

7王海滨，刘立明，鞠连才等. SARS患者红细胞天然免疫黏附功能变化的探讨. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004; 24：181-184

8王海滨，刘西泰，郑晖等. SARS定点工作人员的细胞及红细胞天然免疫黏附功能的变化. 第二军医大学学报，2004； 25：265-267

9曾珍，张晓峰，王海滨等. 红细胞天然免疫黏附功能对判断重症严重急性呼吸综合征预后的价值. 中华传染病杂志，2005; 23：53-54

10孙宝霞，赵新萍，王海滨. 自身免疫性肝病患者红细胞CR1活性的变化及意义. 卫生检验杂志，2004; 14：436-437

11崔晓明，谢海宝，林茂芳等. 四甲基偶氮唑蓝法检测杀伤细胞活性. 中华医学检验杂志，1995; 18：106-107

12王琦，王波，白惠卿. 改良的MTT比色法测定NK细胞杀伤活性. 宁夏医学院学报，1999; 21：86-88

13Caligiuri MA, Velordi A, Scheinberg DA , et al. Immunotherapeutic approaches for hematologic malignancies. Hematology(Am Soc Hematol Educ Program) ,2004: 337-353

14Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A, et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood, 2005；105:3051-3057

15刘希英，吕锐. 肿瘤病人红细胞免疫功能与自然杀伤细胞活性的关系. 青岛大学医学院学报，2003; 39：35-36。