脂质体转染反义脱氧寡核苷酸对K562细胞α珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响
【摘要】 本研究查明脂质体转染反义脱氧寡核苷酸（ASON）对K562细胞α珠蛋白基因表达的抑制作用及对细胞增殖的影响，探讨基因调控β地中海贫血的新思路。 设计合成靶向α珠蛋白基因的ASON，并与正义寡核苷酸（SON）和空白对照进行比较。采用脂质体转染技术将ASON、SON与K562细胞共同培养，用荧光显微术、流式细胞术检测脂质体转染效率，用实时荧光定量RT?PCR法检测K562细胞中α珠蛋白基因表达情况，并通过Cell Counting Kit?8（CCK?8）法观察脂质体转染ASON技术对细胞增殖的影响。结果表明：脂质体转染效率在ASON作用24h达到最高，脂质体转染ASON组的α珠蛋白基因表达水平显著低于SON和空白对照组（p<0.01），并对细胞的增殖有明显的抑制作用，上述效应呈浓度依赖性。结论：脂质体转染ASON能特异性的抑制K562细胞中α珠蛋白基因表达，可能会成为β地中海贫血基因治疗的一个新靶点。
【关键词】 脂质体转染
Effect of Liposomal Transfection of Antisense Oligodeoxynucleotide on Alpha?globin Gene Expression and Proliferation of K562 Cells
Abstract The objective of study was to investigate the effect of liposomal transfection of antisense oligodeoxynucleotide (ASON) on alpha?globin gene expression and proliferation of K562 cells, to explore the new way of gene therapy in β?thalassemia. Targeted ASON of alpha?globin was designed and synthesized, and compared with positive control ［sense oligodeoxynucleotide (SON) group］ and blank control. By liposomal transfection, ASON, SON was co?cultured with K562. The efficiency of trasfection was assayed by fluorescence microscopy and flow cytometry(FCM), the alpha?globin gene expression of K562 was measured by real?time PCR, and the proliferation of K562 was determined by Cell Count Kit?8 assay. The results indicated that the highest efficiency was at 24 hours after liposomal transfection, the gene expression level of alpha?globin in ASON group was significantly lower than that in SON group and blank control (p< 0.01). The proliferation of K562 cells was obviously inhibited, meanwhile the above effect showed the dose?dependent manner. It is concluded that the liposomal transfection of ASON inhibits the alpha?globin gene expression of K562 cells, which may be the new target for gene therapy in β?thalassemia.
Key words alpha?globin gene; liposome transfection; antisense oligodeoxynucleotide; K562 cell; cell proliferation; β?thalassemia
J Exp Hematol 2007; 15(5):1065-1069
β地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病，其病理特征是β珠蛋白基因发生突变，引起β珠蛋白链合成减少，造成α与非α珠蛋白链的比例失衡，α珠蛋白链过剩，在红细胞内形成包涵体，导致骨髓无效红细胞生成和溶血。理论上基因治疗是最理想的方法，因而近20年来基因调控成为倍受人们关注的β地中海贫血治疗方法之一。目前针对β地中海贫血的基因调控治疗研究较多的停留在导入正常的β珠蛋白基因，或对剪接缺陷突变的β珠蛋白链修复上，使之恢复正常剪接，产生正常的β珠蛋白链。与其他研究不同之处在于，我们设计靶向α珠蛋白基因的ASON，通过基因调控技术，从分子水平封闭部分α珠蛋白基因，以期待能抑制相应的α珠蛋白链合成，改善α与非α珠蛋白链的比例失衡状况，为探讨基因调控治疗β地中海贫血寻找新的靶点。我们以K562细胞作为实验对象，用脂质体作为转染ASON的载体以增加细胞的吸收度及提高导入率， 观察其对 K562 细胞 α 珠蛋白基因表达的抑制作用及对细胞增殖的影响。
K562 细胞的培养及传代
将K562 细胞（购自院上海细胞生物学研究所）接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640 (Gibco BRL 公司产品)培养液中，置于37℃、 5% CO2 、饱和湿度的培养箱中培养，细胞生长良好，隔天换液并传代1次，细胞处于对数生长期成活率>95%。
寡核苷酸（全硫代）的合成和纯化
从GenBank（序列号为：BC005931）获得α珠蛋白基因mRNA全序列，利用RNA structure 4.2设计ASON，并用前期预实验进行分析和筛选；获得最佳ASON序列：5′?CAGCACCATGGTGGGTTCTC ?3′， SON序列：5′?GTCTTGTCGGCAGGAGAC?3′。全硫代反义脱氧寡核苷酸由上海英骏生物技术有限公司合成和纯化，并在寡核苷酸3′端带入异硫氰酸荧光素（FITC），以便检测脂质体转染效率。
寡核苷酸的脂质体转染
按照脂质体（Oligofectamine，Invitrogen，Cat. No. 12252?011）说明书中的步骤操作，在转染前1天将K562细胞按5×104 cells/ml在无血清条件下接种于24孔培养板；脂质体、寡核苷酸均用Opti?MEM? I Medium (Invitrogen，Cat. No.31985-062）溶解，ASON组稀释为0.20 μmol/L，0.25 μmol/L，0.50 μmol/L 3个浓度，每个浓度3孔，并设置空白对照组、SON组（浓度为：0.50 μmol/L），置于37℃、5% CO2 、饱和湿度的培养箱中培养72小时。
脂质体转染的荧光显微镜观察
分别于寡核苷酸作用6、24、48及72小时后，在倒置相差荧光显微镜（Zeiss Axiovert 200）下观察脂质体转染情况。
脂质体转染效率的流式细胞术检测
分别于寡核苷酸作用24、48及72小时，取部分K562细胞，经PBS液洗涤2次，上流式细胞仪（Beckman Coulter公司产品，Epics XL型）进行检测，数据采用Cell Quest软件分析。
K562细胞中α珠蛋白基因表达的实时荧光定量RT?PCR法检测
RNA 提取 参照TRIzoL试剂说明书分别提取上述各细胞中的总RNA。用紫外分光光度计测RNA浓度(RNA浓度=A260 ×40 μg/ml ×1 /光径×稀释倍数)及纯度(A260/A280比值在1.8-2.0) ,再用2%琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量,而后RNA可储存于 -80℃备用。
cDNA合成 根据TaqMan逆转录试剂盒［RNA PCR Kit(AMV）Ver.3.0， Cat No. DRRO19A ］说明书，把1 μg总RNA反转录成为单链cDNA，反应获得cDNA储存于-20℃备用。样品准备, PCR加样和PCR产物检测分析均在相互独立的环境中完成。
实时荧光定量PCR iCycler iQTM荧光实时PCR仪为美国Bio?Rad公司产品。
Table. PCR sequence
PrimerSequence(5′?3′)Amplified
fragmentα?globin geneCTGCCGACAAGACCAAC129 bpCGAAGTGCGGGAAGTAGGAPDHAATGGAAATCCCATCACCATCT86 bpCATCGCCCCACTTGATTTTG
PCR反应试剂SYBR○R GreenERTM qPCR SuperMix for iCycler○R采购自Invitrogen公司（Cat No.11761-100）。PCR反应体系20 μl含SuperMix，cDNA模板1 μl，引物各5 pmol。PCR反应条件为：50℃ 预热2分钟（激活UNG酶），95℃ 8分钟30秒 (灭活UNG酶, 同时激活DNA聚合酶)，紧接着40个循环的95℃(变性) 15秒和60℃ (退火和延伸) 1分钟，热循环完成后进行55℃-95℃的融解曲线测定，PCR反应结束后由电脑自动分析出定量结果。所有样品检测实验均包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果。每个样品中α珠蛋白基因的相对mRNA表达水平可以用以下公式
相对mRNA表达=2-ΔΔCt［1］
脂质体转染寡核苷酸作用后K562细胞的增殖的CCK?8法检测
按上述制备寡核苷酸的方法获得相同的各组。CCK?8试剂盒（Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan)说明书的步骤，分别取100 μl接种于96孔板，每1个浓度设置3个复孔，共铺置3块96孔板，分别用于观察寡核苷酸作用24、48小时及72小时后K562细胞的增殖情况。向96孔板中各孔加入10 μl CCK?8试剂，混匀，放入37℃、5% CO2 、饱和湿度的培养箱中孵育4小时，直接置于酶标仪（Thermo electron corporation, Multiskan MK3）测A450吸光度值（A值），计算细胞生长抑制率（IR），其公式为
IR=［（空白对照组A值-给药组A值）/（空白
对照组A值-本底组A值）］×100%
统计学方法
实验数据采用± SD表示，用SPSS 13.0软件进行重复测量资料的方差分析。
结 果
脂质体转染 ASON情况
开始转染后6小时，可见带有荧光素的ASON与K562细胞接触，部分已融合。转染24小时荧光显微镜下显示出较好的转染效果，可观察到部分完整的细胞形态，呈圆形，显现出绿色荧光；此后的第48、72小时，仍可获得上述转染效果，但由于K562细胞的分裂增殖作用，部分处于细胞质的ASON被传至下一代细胞，致使单个细胞内的荧光素减少，荧光显微镜下表现为荧光强度减弱，并呈逐渐减弱的趋势（图1） 。
随寡核苷酸的浓度增加，转染效率逐渐提高；同时在同一浓度下，转染效率随作用时间的递增而逐渐减低，这与荧光显微镜观察的结果相符（图2）。
脂质体转染寡核苷酸作用后α珠蛋白基因的表达情况
检测结果表明，与空白对照组比较，ASON作用后α珠蛋白基因表达均有不同程度的下降，当ASON浓度达到0.25 μmol/L以上时，α珠蛋白基因表达受到明显抑制（p<0.01），以0.50 μmol/L 作用48小时的效果最明显，表现为一定的时间、浓度依赖性。ASON作用72小时后对α珠蛋白基因的抑制减弱，相对表达量较前增加。相对于空白对照组，SON作用后α珠蛋白基因相对表达量无明显的改变（p>0.05）(图3) 。
Figure 3. Inhibitory effect of oligodeoxynucleotide on expression level of alpha?globin gene by real?time PCR. # P>0.05，* P<0.05，** P<0.01, compared with blank control.
脂质体转染寡核苷酸作用后K562细胞的增殖情况
浓度为0.20、0.25 μmol/L的ASON作用于K562细胞后，对细胞产生一定的生长抑制作用，表现出相应的浓度依赖性，并随时间的增长生长抑制效应减弱；当浓度为0.50 μmol/L时，上述抑制作用最明显（p<0.01），并一直维持72小时。同时，经全硫代修饰的SON也显现出一定的细胞生长抑制效应（图4）。
Figure 4. Inhibitory effect of oligodeoxynucleotide on growth of K562 cells by CCK?8 assay. *P<0.01, compared with blank control.讨 论
反义核酸技术是根据核酸杂交原理设计以选择性抑制特定基因表达为目的的基因调控技术，广义地说，反义寡聚核苷酸、人工核酶及RNA?DNA嵌合体都属于反义核酸。传统的反义寡聚核苷酸技术已成功地在相应的细胞系中用于基因功能的筛选［2-4］。同时，反义寡聚核苷酸技术在体外实验中被广泛应用于评价基因功能和证实基因作用靶点［5-7］。本实验通过前期预实验筛选出最佳的ASON序列，该序列符合ASON设计的基本原理［8］，通过进一步实验了解其对α珠蛋白基因表达的调控作用，及对细胞增殖情况的影响，以获取ASON最佳作用浓度。实验证实，浓度为0.25、0.50 μmol/L的ASON作用于K562细胞24小时和48小时均能明显减少α珠蛋白基因表达，并显著抑制细胞生长，表现出时间和浓度依赖性。同时，由于ASON对基因的调控作用有明显的浓度依赖性［9］，单次加药的ASON作用有限；且K562为白血病细胞株，增殖能力旺盛，ASON作用72小时时对基因表达及细胞增殖的影响逐渐减弱，这正是瞬时调控最大的不足之处。
为提高转染效率，防止ASON在细胞内降解，达到更明显的基因调控作用，我们采用了不同以往的人工阳离子脂质体——oligofectamine。与传统使用的lipofectamine 2000相比，oligofectamine更特异性转染寡核苷酸进入真核细胞，并能保证较高的稳定性、较好的特异性及较低的毒性［10，11］。在oligofectamine作用下，ASON最佳浓度为0.05-0.25 μmol/L，本实验所用的3个浓度分别为0.20、0.25和0.50 μmol/L。结果提示，0.25 μmol/L及0.50 μmol/L有较好的调控效果；但0.50 μmol/L时在oligofectamine介导下ASON表现出明显的细胞抑制作用。此外，SON组也有细胞增殖受抑的表现，这可能与硫代寡聚核苷酸的非特异性细胞毒性作用、脂质体对细胞膜的损伤等因素有关，这与费嘉等［12］的报道相符。综合上述结果，我们选取0.25 μmol/L作为ASON最佳作用浓度，以获得较理想的基因调控作用。
在本研究中，我们采用了Cell Counting Kit?8（CCK?8）试剂检测ASON对K562细胞增殖作用的影响［13，14］。CCK?8试剂是一种水溶性的四唑盐类，可被活细胞的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲月赞染料（formazan dye），生成的甲月赞物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。该试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释，省去了溶解除沉的操作，只需一步即可得到结果，步骤少，无损失，灵敏度高于MTT、XTT和MTS，更适用于检测悬浮细胞。
人红白血病细胞株K562能稳定表达α珠蛋白基因［15-18］, 国外Ponnazhagan等［18］构建了反义α珠蛋白RNA的腺相关病毒（AAV）重组体，将重组体感染高水平表达K562细胞。结果显示：重组体可抑制内源性α珠蛋白基因，最大抑制量为91%。我们选取K562细胞株作为实验对象，通过本研究证实脂质体转染特异性ASON作用于K562细胞，能较好的封闭α珠蛋白基因，使其表达量下调，这为后期选取适宜的ASON作用于β地中海贫血提供了实验依据。β地中海贫血中因β珠蛋白链合成异常，致使α、β珠蛋白链之间合成不平衡，多余的α链形成不稳定四聚体，在RBC内沉积，造成无效造血和成熟红细胞在微循环被破坏，导致溶血。目前国内外的学者主要侧重于对β珠蛋白链的研究，而甚少关注α珠蛋白链。不同于以往国内外的研究，我们设计针对α珠蛋白基因的ASON，通过封闭部分α珠蛋白基因，抑制相应的α珠蛋白链合成，改善α与非α珠蛋白链的比例失衡状况，减少RBC内包涵体的形成，减轻或缓解RBC溶血，达到β地中海贫血的目的，为探讨基因调控治疗β地中海贫血寻找新的靶点。
【】
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