血小板衍生膜微粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响
作者：陈宝安， 仲悦娇， 黄成垠， 李翠萍， 史光耀，肖建宇， 唐荣才 丁家华，
高冲，孙耘玉， 程坚 ， 王骏， 赵刚， 马燕， 宋慧慧， 费菲， 裴孝平
【摘要】 本研究探讨血小板衍生膜微粒(platelet?derived membrane microparticles, PMP)对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管形成的影响。用凝血酶激活血小板释放出PMP，再经高速离心 分离出PMP，用流式细胞仪检定PMP，并用BCA法测定PMP的含量。将PMP接种于鸡胚绒毛尿囊膜上，观察PMP对CAM血管生成的影响。结果显示：当 PMP的浓度为80 μg/ml时，孵育72小时后混合纤维素滤膜周围可见到放射状密集生长的血管网, 血管分支数为112.5±11.31 ，血管面积为（6.19±1.29）﹪，而在对照组无特异性密集血管生成，血管分支数为82.6±8.05，血管面积为1.78±0.33，二组比较有显著性差异（P＜0.05）；而与VEGF组比较，后者的血管分支数为128.4±10.02，血管面积为7.44±1.36，二组比较差异无显著性。结论： PMP对CAM新生血管的生成有促进作用。
【关键词】 血小板膜衍生微粒
Effects of Platelet?derived Membrane Microparticles on Angioge?nesis in Chick Chorioallantoic Membranes
Abstract This study was purposed to investigate the angiogenesis effect of platelet?derived membrane microparticles (PMPs) in chick chorioallantoic membranes (CAM) . Thrombin were adopted to activate the platelets and then PMPs were obtained. PMPs were isolated by high speed centrifugation. Flow cytometry (FCM) was adopted to evaluate the efficiency of thrombin to produce PMPs and BCA method was adopted to evaluate the content of PMPs. PMPs were put into CAM and the effects of PMPs on angiogenesis in CAM were observed. The results indicated that after incubation for 72 hours at the concentration of 80 μg/ml PMPs, the vessel nets in a ‘spoked?wheel’ pattern were shown around mixed fibrous filter membranes, number of vessel ramification was 112.5±11.31 and ratio of vessel area/CAM area was 6.19±1.29﹪, but there were not localized allantoic vessels developing in the control group, the number of vessel ramification and ratio of vessel area/CAM area in control group were 82.6±8.05 and 1.78±0.33 respectively, so there was significant difference between PMP and control groups. In above mentioned conditions, the number of vessel ramification and ratio of vessel area/CAM area in VEGF group were 128.4±10.02 and 7.44±1.36 respectively, so there was no difference between PMP and VEGF groups. It is concluded that PMPs show promotive effect on the formation of capillaries in chick chorioallantoic membranes.
Key words platelet?derived membrane microparticle； chick embryo chorioallantoic membrane; angiogenesis
血小板衍生膜微粒（platelet?derived membrane microparticles, PMP）是血小板在钙离子载体、凝血酶、高切应力、胶原、细胞因子等诱导剂激活的过程中产生的直径小于1.0 μm的小囊泡颗粒。这种微粒具有促凝活性,可黏附于血管内皮细胞,增强正常血小板的黏附能力［1］，并含有多种特异性膜糖蛋白和生物活性受体，是血小板活化的标志之一。最近的研究证实，血管生成因子（FGF?2和VEGF）的水平和PMP水平有着很强的相关性［2］。PMP能刺激内皮细胞增殖、迁移并影响细胞形态，以促进血管生成的发生［3］。本实验将PMP与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）共同孵育观察PMP对CAM新生血管的影响。
材料和方法
仪器
血细胞分离机为Bexter Fenwel CS?3000。解剖显微镜为Olympus?ck2。数码相机：日本佳能公司产品，型号：I?ZOOM。二氧化碳培养箱为日本Hirasawa公司产品，型号：WJ?12C。油电两用恒温培养箱：上海医疗器械七厂产品，型号：PYX?YDH?40×50。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。0.8 μm混合纤维素滤膜购自Drummond公司。
血小板悬液由江苏省血液中心成份科提供，均为血细胞分离机采集的健康供血者的新鲜血小板，浓度为（900-1200）×109/L。将血小板悬液于22±2℃经2 500 rpm离心10分钟，沉淀物悬浮于缓冲液中(Na2EDTA： 9 mmol/L, Na2HPO4：26.4 mmol/L, NaCl:140 mmol/L),并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrode缓冲液中(NaCl：137 mmol/L, NaCHO3：12 mmol/L, 葡萄糖：5.5 mmol/L, KCl：2 mmol/L，MgCl: 1 mmol/L, NaHPO4：0.3 mmol/L)。调整血小板浓度为8×108/ml。采用1.0 U/ml的凝血酶激活血小板（放37℃恒温摇床上振荡30分钟）。激活后的血小板于4℃， 4 000 rpm离心20分钟,上清分离于另一试管中，于4℃， 17 000 rpm， 离心1小时，并洗涤1次，沉淀物悬浮于Tyrode缓冲液中［4，5］，整个操作在无菌条件下进行。
血小板衍生膜微粒的定量
等量1％多聚甲醛固定PMP后用CD61标记PMP，选择直径1 μm的微粒确定PMP的直径阈值，同时设定同型对照。用流式细胞仪分析高速离心前后PMP的纯度。采用BCA蛋白浓度定量试剂盒检测PMP的浓度，步骤如下：根据样品数量，将BCA试剂A∶B按50∶1的比例配成BCA工作液，充分混匀。用缓冲液II溶解蛋白标准品，蛋白标准品的终浓度为0.5 mg/ml。将标准品按0、1、2、4、8、16、20 μl分别加入96孔板中，加缓冲液II补足到20 μl。加20 μl PMP到96孔板各孔中，各孔中加入200 μl BCA工作液，37℃放置30分钟。用酶标仪测定570 nm处各孔吸光度，根据标准曲线判断PMP的蛋白浓度。
种蛋的消毒和孵育
纯种华联司法部购自南京制药机械厂。利用光照选择钝端气室小的鸡卵（产蛋时间为7天），要求表面清洁，蛋壳均质，每个50-65 g，蛋形规范。种蛋用温水清洗、擦干，于40℃-45℃的新洁尔灭液（1∶1 000稀释）中浸泡3分钟，擦干放入蛋托，用紫外线消毒30分钟备用。将隔水式电热恒温培养箱通电预热，使温度升至37.0℃。种蛋孵育于隔水式电热恒温培养箱，温度37.0℃±0.5℃，培养箱中同时放入一小烧杯水，保持湿度在40%-60%。种蛋气室向上，蛋托与胚蛋长轴约呈70-80°，每天早晚各小心转动1次。
PMP对CAM新生血管的影响
取孔径为0.8 μm的混合纤维素滤膜,用打孔器制成直径5 mm的小圆片,放蒸馏水浸泡后，灭菌备用。取孵化的9日龄胚蛋，随机分为4组，每组20只蛋。在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区，划定1 cm×1 cm圆形开窗位置，在鸡胚气室端钻1 mm小孔并穿透壳膜。用75% 乙醇消毒开窗部位，用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出鸡胚绒毛尿囊膜，将混合纤维素滤膜放置于尿囊膜上血管较少的部位。实验分组： 对照组（生理盐水）； 40 μg/ml PMP组； 80 μg/ml PMP组； 10 μl/ml VEGF组。用微量进样器分别将上述液体20 μl滴入滤膜中，然后用无菌透明胶带封窗，放入孵化箱，继续孵化。3天后揭去透明胶带，加入适量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15分钟。然后以混合纤维素滤膜为中心，剪取3 cm的CAM，放入盛有水的平皿中展开，然后平铺于滤纸上，制成CAM标本。
结果判断
在解剖显微镜下观察鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长情况,数码相机进行原位摄影。用扫描仪扫描底片,选取画面清晰者, 选用Imagetool 软件处理图像统计出混合纤维素滤膜周围5 mm范围内的血管分支点数［6］，并出所选区域血管面积与CAM面积的比值。
统计分析
利用SPSS 10.0统计软件，计数资料用秩和检验。
结 果
制备的PMP的纯度鉴定
流式细胞仪检测结果表明，1.0 U/ml凝血酶作用后的PMP释放率为50.1%； 17 000 rpm离心1小时后PMP的纯度>99％（图1）。
实验开始时,每组鸡胚数为20个,到第11天取膜时各组存活的鸡胚均在15枚以上。对照组CAM血管形态呈生长状态下的叶脉状(图2A) , 40 μg/ml PMP组与对照组无差别，80 μg/ml PMP组及VEGF组在混合纤维素滤膜周围可见到不同程度放射状密集生长的血管网(图2B、2C) ,而对照组及低
Figure 2. Allantoic vessels in three groups after incubation for 72 hours. A: normal growth of blood vessels in chick chorioallantoic membrame; B: blood vessel net in a spoked wheel pattern; C: vasoproliferative response comparable to that induced by VEGF (Original magnification:×6.1)
浓度PMPs组均无特异性密集血管生成。各组CAM血管分支点数及血管面积的比较见表1。当PMP的浓度为80 μg/ml时，CAM的血管生成表现形式、血管分支点数和血管面积均优于对照组,与对照组比较差异有显著性(P<0.05),但与VEGF组比较差异无显著性(P>0.05)。结果表明，PMP（80 μg/ml）对CAM新生血管的生成有明显促进作用。
讨 论
PMP是血小板在诱导剂作用下，细胞膜以出芽方式形成囊泡或伪足断裂而形成直径<1.0 μm的小囊泡颗粒，PMP在止血过程中起着重要作用。PMP具有完整的膜结构，表面含有多种特异性膜糖蛋白和生物学活性的受体，可通过与靶细胞的相互作用启动靶细胞的生物学效应［7］。研究表明，血小板膜衍生微粒可促进人脐静脉内皮细胞、平滑肌细胞、骨细胞、人类造血干细胞等的增殖。PMP计数和定量检测的方法有FCM、ELESA、毛细管电泳、透射电镜（TEM）、原子力显微镜(AFM)等。由于FCM操作简单，提供的信息丰富，是最为可取的检测PMP的方法，故本次实验采用FCM来定量测定PMP。Baj?Krzyworzeka等［8］采用凝血酶、凝血酶和胶原、超声和Ca2+载体通道A23187激活血小板后分析PMP表面黏附分子CD41、CD62P、CXCR4、凝血酶受体PAR－1等表达情况，发现凝血酶激活血小板后获得的PMP的黏附分子表达情况与生理情况下产生的PMP黏附分子表达情况最为接近，故本实验采用凝血酶激活血小板。PMP与血管内皮细胞、白细胞及黏附分子间有桥联关系，同时影响THP?1细胞、血管内皮细胞等的功能，参与炎症反应时的血管损伤［9］。Hyun等［3］的实验证实，PMP在体外有促进内皮细胞增殖、迁移、趋化和血管形成的功能，此外PMP能刺激离体的内皮祖细胞（EPC）生长。因此，通过EPC 数量的增加，在创伤修复部位和一些病理状态（如肿瘤）的过程中产生的 PMP与新生血管形成密切相关。Alexander等［10］通过鼠主动脉环、细胞侵袭实验和琼脂糖小球移植术、人造心肌缺血鼠模型，也证实了PMP在体内和体外均能促血管生成，而且在局部缺血的心肌层注射PMP可以增进慢性局部缺血的血管再形成过程。本科研小组［11］曾应用Ficoll分离脐血单个核细胞，在含有100 μg/ml及50 μg/ml PMP的甲基纤维素半固体培养基中培养7-10天，观察CFU?GM集落形成情况。结果显示，PMP可促进脐带血造血干细胞的增殖、黏附和归巢，故PMP在造血干细胞移植领域中可能具有很好的应用前景。本科研小组［12］还曾把PMP与人脐静脉内皮细胞共同孵育，结果显示PMP可促进人脐静脉内皮细胞的增殖并抑制其凋亡。
血管新生是指从已经存在的毛细血管或微静脉通过内皮细胞增殖和迁移, 最后以芽生或非芽生的方式扩展出更多的血管网。由于鸡胚处于对各种外来抗原免疫耐受阶段,对所加测试药物不会产生排斥反应,而且实验结果可在解剖显微镜下或肉眼下直接观察,并可将图像输入机,进一步观察新生血管情况,量化观察指标，鸡胚尿囊膜技术已成为国内外研究血管生长常用的实验技术。与其它动物模型相比,鸡胚生命力较弱,对环境变化敏感,抗感染力差。而且,发育时间越短越是如此。在鸡胚发育前10天中有一个死亡高峰,出现在鸡胚发育的3-5天。而5天后鸡胚发育进一步完善,7天时鸡胚已可自己产生体温,对外界环境变化适应力增强,死亡率大大降低。直到第8天时散在分布于中胚层的不成熟血管才形成毛细血管丛,覆盖在绒毛上皮细胞表面。毛细血管快速增殖持续到第11天，此后内皮细胞有丝分裂指数迅速下降［13］, 到第18天, 血管系统最终形成。鸡胚孵化至第8天 时, 胚膜和血管网的发育已趋稳定, 而机体免疫系统尚未完全建立, 此时对各种异物几乎不产生排斥反应, 便于观察各种诱导剂和抑制剂对血管生成的影响。本实验选择鸡胚发育的第9 天为给药期，位于CAM 血管发育的中期，是CAM 血管生长的高峰时间，可以明确地观察到PMP促血管生成的作用。经过72小时的孵育，结果显示PMP(80 μg/ml)组及VEGF组在混合纤维素滤膜周围均可见到不同程度放射状密集生长的血管网，而对照组与低浓度PMP组无特异性密集血管生成。PMP(80 μg/ml)组及VEGF组在血管生成的表现形式、血管面积和血管分支点数计数方面均优于对照组及低浓度PMP组，差异有显著性(P<0.05) ,但PMP(80 μg/ml)组及VEGF组比较差异无显著性(P>0.05)。因此可以得出结论，PMP在体内能有效的促进血管的生成，但确切的作用途径有待进一步研究。
【】
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12仲悦娇，陈宝安，黄成垠等. 血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响. 中国实验血液学杂志，2007； 15：858-861
13Ribatti D, Vacca A, Roncali L, et al. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti?angiogenesis. Curr Pharma Biol, 2000; 1: 73-82
