以皮肤损害和骨髓增生异常综合征首发的双表型急性白血病
作者：刘英，唐锁勤，杨光，冯晨，刘立真，雷琦
【摘要】 本研究通过实例分析双表型急性白血病的临床、病理和生物学特征，用骨髓细胞涂片观察肿瘤细胞的形态，流式细胞术和免疫组织化学检测肿瘤细胞的免疫表型，常规染色体分析和多重巢式RT?PCR检测染色体畸变。结果表明：本例以皮肤损伤和骨髓增生异常综合征为首发表现，诊断时骨髓原始细胞超过30%，合并脑膜浸润；肿瘤细胞体积大，同时表达髓系标记（cMPO、CD33和CD117）和T淋系标记（cCD3、CD5、CD7、CD4和CD8双表达），并强烈表达最早期造血祖细胞标记CD43和CD99，染色体核型正常，检测到MLL基因的部分串联重复。最后诊断为双表型急性白血病。结论：双表型白血病的前期可表现为骨髓病态造血，其临床和生物学行为具有高度侵袭性，应用免疫表型、细胞遗传学和分子特征分析有助于这类疾病的早期诊断和预后评估。
【关键词】 双表型急性白血病
Skin Lesions and Myelodysplastic Syndrome as Initial Manifestations of Biphenotypic Acute Leukemia
Abstract The aim of this study was to investigate the clinical, pathological and biological features of biphenotypic acute leukemia. The morphology of tumor cells was observed by bone marrow examination; the immunophenotype was assayed by flow cytometry and immunohistochemistry; the chromosomal aberrations were detected by conventional chromosomal analysis and RT?multiplex nested PCR. The results showed that extramedullary skin lesions and myelodysplasia occurred before the onset of overt disease. At the time of diagnosis, this case had more than 30% blasts in bone marrow with meningeal involvement. Large?sized tumor cells predominated morphologically over other cells. Flow cytometry revealed the co?expression of myeloid antigens (cMPO, CD33 and CD117) and T?lymphoid antigens (cCD3, CD5, CD7, dual expression of CD4 and CD8). Immunohistochemical staining showed that CD43 and CD99 were strong positive which define the earliest hematopoietic progenitors. Partial tandem duplication of the MLL gene could be detected with normal cytogenetic method. All above?mentioned results led to the diagnosis of biphenotypic acute leukemia. It is concluded that the biphenotypic acute leukemia is an uncommon type of leukemia which may be preceded by myelodysplastic syndrome and has aggressive clinical and biological behavior. Immunophenotype, cytogenetics and molecular analysis can contribute to early diagnosis of BAL and evaluation of prognosis.
Key words biphenotypic acute leukemia; myelodysplastic syndrome; immunophenotype; MLL gene partial tandem duplication
双表型急性白血病（biphenotypic acute leukemia, BAL）是一类临床少见、诊断困难、预后不良的白血病。BAL起源于骨髓多能造血干细胞，具有多系分化潜能，常同时表达髓系和B淋系或T淋系抗原，发病时多以高白细胞数伴外周血幼稚细胞［1］。以皮肤损伤和骨髓增生异常综合征为首发的双表型急性白血病在目前未见有报道。本研究通过实例分析此类型白血病的临床、病理和生物学特征。
材料和方法
病例
患儿，男，3岁10个月，因皮肤结节性红斑伴面色苍白半年、右眼睑肿物1月、发热20天于2006年5月入院。半年前患儿背部及双下肢皮肤有数个结节性红斑，面色苍白。当时查体未发现肝脾浅表淋巴结肿大。血常规检查显示全血细胞减少。抗核抗体及EBV、CMV、人细小病毒B19等病毒抗体检测均无异常。骨髓象显示：细胞少，分布不均；原始细胞占24.5%；粒系增生不良，晚幼粒细胞及以下各阶段比值减低，成熟阶段细胞浆内可见中毒性颗粒；红系增生不良，偶见中晚幼红细胞；成熟淋巴比值偏高，占40.5%；巨核细胞不减少，小巨核占4.5%，尾部可见成堆小巨核。当时诊断：骨髓增生异常综合征，不除外急性髓系白血病转化可能。输注2个单位红细胞，此后3个月患儿未接受。皮肤结节性红斑缓慢增多增大，外周血三系细胞逐渐恢复正常。骨髓象复查结果：实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)以皮肤损害和骨髓增生异常综合征首发的双表型急性白血病增生活跃；3%原幼细胞；粒系增生，以中性杆状核细胞为主，形态未见明显异常；红系增生活跃，以中晚幼红细胞为主，可见嗜碱性点彩、H?J小体及巨幼样改变，成熟红细胞大小明显不均，嗜多色性红细胞易见；淋系无特殊；巨核全片214个。1个月前家长无意中发现患儿右眼眶皮下肿物，MRI检查不除外泪腺瘤病变。10天后患儿开始发热，全血细胞再次减少。骨髓中发现75%瘤细胞，胸部CT检查无异常发现，超声检查示脾大，24小时尿VMA正常。经抗感染、输血等治疗，患儿右眼眶皮下肿物缩小，皮肤结节性红斑无变化，体温未恢复正常，全血细胞仍减少。入院查体：中度贫血貌。面部、躯干和四肢皮肤弥漫分布大小不等结节性红斑(图1)，质硬，无压痛。右下颌皮肤触及一个指甲盖大小肿物，质硬，无粘连。右上眼睑内侧一个黄豆大小的肿物，质硬，无粘连。左眼内眦见一个紫红色肿物。浅表淋巴结未触及肿大。心肺听诊无异常。肝于右肋下3 cm，脾肋下未触及。入院后复查骨髓象并进行骨髓活检、皮下结节活检和脑脊液检查。最后诊断：①双表型急性白血病；②脑膜白血病。给予VDLP（长春新碱+地塞米松+吡柔比星+左旋门冬酰胺酶）诱导缓解化疗。化疗1周皮肤损伤消退，第21天骨髓幼稚细胞消失，三联鞘注1次后脑脊液中白血病细胞消失。化疗第35天粒系造血开始恢复，患儿自动出院。3个月后Hb和Plt仍无回升，且出现发热，患儿未再接受检查和治疗。
细胞形态学和细胞化学检测
骨髓涂片和脑脊液涂片经常规瑞氏染色分类计数。骨髓涂片按常规方法行髓过氧化物酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色及NaF抑制实验、糖原染色。
免疫分型检测
取肝素抗凝骨髓2 ml，分离单个核细胞。采用三色直接免疫荧光标记法。所用异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白荧光素（PE）或多甲藻叶绿素蛋白（Percp）标记的鼠抗人单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司产品）包括髓系相关的CD13、CD33、CD14、CD16、CD56、CD64、CD117和cMPO；T系相关的cCD3、CD3、CD4、CD5、CD7和CD8；B系相关的CD10、CD19、cCD79a、cIgM、Kappa和Lambda轻链；干/祖细胞系的CD34和HLA?DR。向100 μl单个核细胞悬液中加入荧光抗体20 μl，置室温避光孵育20分钟，再加入溶血素2 ml，震荡置室温避光孵育10分钟后用2 ml PBS洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司产品）和CellQuest软件获取并分析10 000个细胞。胞浆抗原的检测参照渗透试剂盒说明书进行。通过CD45/SSC设门识别幼稚细胞群，再分析该细胞群的抗原表达情况。阳性判断标准：淋系抗原阳性细胞≥30%，髓系抗原阳性细胞≥20%，胞浆抗原阳性细胞≥10%，干/祖细胞抗原阳性细胞≥20%。分型依据欧洲白血病免疫分型组的积分标准（EGIL）［2］。
免疫组织化学检测
石蜡包埋皮肤结节和骨髓的活检组织，连续切片，厚5微米。采用链酶亲和素?过氧化物酶法（SABC）检测。鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色剂均购自北京中山生物技术有限公司。切片脱蜡水化；微波煮沸抗原修复2次各5分钟；3% H2O2甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶，37℃孵育30分钟；用非免疫动物血清室温封闭30分钟；加入一抗，4℃过夜；加入二抗，37℃孵育30分钟；加入酶结合物，37℃孵育30分钟；DAB显色，苏木素复染、分化、促蓝、脱水、透明、封片。
细胞遗传学检测
取肝素抗凝骨髓2 ml，常规培养48小时，制备染色体标本，R显带，显微镜下分析20个中期细胞。按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）1995》描述核型。
融合基因检测
采用多重巢式RT?PCR方法［3］筛选白血病29种染色体畸变形成的融合基因。PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色。
结 果
骨髓和脑脊液涂片结果
骨髓 增生减低；细胞体积大的原始细胞占30.2%；早幼粒细胞及以下阶段占10.4%；红系占5.2%，各阶段细胞可见，原始红细胞比值增高，中晚幼红细胞比值明显减低，偶见核畸形，成熟红细胞形态未见异常；淋系占36.8%；巨核可见，血小板少，可见小/亚小巨核、吞噬（吞RBC、Plt）细胞、浆细胞及成纤维细胞，过氧化物酶染色阳性率3.5%（图2 A）。
脑脊液 白细胞总数123×106/L；生化指标正常；脑脊液涂片：有核细胞甚多，几全为肿瘤细胞，细胞有轻度退行性变，呈团块分布（图2 B）。
免疫组织化学结果
左大腿外侧皮肤活检组织学和免疫表型 表皮未见异常，真皮及皮下组织内见肿瘤细胞弥漫片状浸润。细胞体积大，胞浆宽、淡染，核大而圆，中位、单个核仁，清楚，核分裂像易见（图3 A-B）。肿瘤细胞侵及神经束膜。形态上符合侵袭性肿瘤，结合发病年龄考虑母细胞阶段的肿瘤。用免疫组化方法进行蛋白水平的检测。结果显示：TdT－，ALK－，CD99+，CD43+，CD3(灶状少数细胞阳性)，CD10－，CD20－，CD79a－，MPO(孤立灶状细胞阳性)，lysosome－，CD15－，Ki?67(阳性>95％)（图3C-F）。ALK阴性排除了间变性大细胞淋巴瘤的可能。CD99和CD43阳性支持淋巴母细胞的分化。CD20、CD79a和CD10阴性排除B淋巴母细胞可能，而CD3灶状阳性提示肿瘤细胞起源于T淋巴母细胞，MPO灶状阳性提示肿瘤细胞同时具有髓细胞的分化。CD15阴性不支持粒细胞性白血病。Ki?67的高表达支持肿瘤细胞增殖活跃。病理诊断：左大腿外侧皮肤非霍奇金淋巴瘤。WHO：前T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病，伴有髓细胞分化。
Figure 3. Histopathology and immunophenotype of skin lesions in the patient with biphenotypic acute leukemia. Large?sized tumor cells diffusely infiltrated into dermal (A?B) (HE staining; ×200). The tumor cells strongly expressed CD43 (C) and CD99 (D), locally express CD3 (E) and MPO (F) (SABC; ×400).
髂后上棘骨髓活检组织学和免疫表型 骨髓腔内细胞成分减少，纤维组织增生，未见巨核细胞。红系及粒系细胞存在。可见少数体积中等的具有一定异型性的细胞增生浸润。一系列免疫组化检测显示：骨髓内见灶状CD43阳性细胞团，CD3阳性，并有CD99表达，支持灶性增生细胞为肿瘤细胞，骨髓受累。
免疫分型检测结果
CD45/SSC设门识别一群幼稚细胞占10.3%。该群细胞同时表达干/祖细胞抗原CD34（34.8%）和HLA?DR（62.7%）；髓系抗原cMPO（14.9%）、CD33（37.6%）和CD117（20.6%）；T淋系抗原cCD3（10.0%）、CD2（53.63%）、CD4+CD8+（9.17%）、CD5（48.6%）和CD7（77.2%）。某些髓系（CD13）和T淋系（CD3 和cTdT）标志未表达（图4）。髓系抗原积分4.0分，T淋系抗原积分4.5分。
染色体核型分析和融合基因检测结果
骨髓细胞染色体核型正常，为46XY。多重巢式RT?PCR检测到混合系白血病基因的部分串联重复（MLL PTD）。
讨 论
以髓外皮肤损伤和骨髓增生异常综合征为首发表现是本例的突出特点。患儿起病时除皮肤损伤外未发现肝脾淋巴结肿大和明确占位性病变；外周血三系细胞减少、未见幼稚细胞，骨髓粒红两系细胞增生低下、淋巴样小巨核细胞明显增多、原始细胞比例占20%-30%。Polychronopoulou 等［4］分析34例骨髓增生异常综合征（MDS）患儿的外周血、骨髓穿刺和骨髓活检样本，结果显示：骨髓增生低下是儿童MDS在形态上不同于成人的显著特征，伴有红系和（或）巨核系的病态造血、幼稚前体细胞异常分布（ALIP）、骨髓纤维化或骨髓基质改变等。本例起病时的骨髓改变与上述特征相符，可诊断为MDS（RAEBT型）。结合患儿在诊断时有发热、脾大等全身表现以及骨髓75%肿瘤细胞，临床初步诊断：以髓外皮肤损伤和骨髓病态造血为首发的造血系统恶性肿瘤。
皮肤是结外淋巴瘤第二常见的部位。按照WHO?EORTC分类，原发皮肤的结外淋巴瘤为外周淋巴细胞起源，近90%临床行为呈惰性，5年无病生存率75%以上。NK/T细胞、γδT细胞、CD8+T细胞和弥漫大B细胞的原发皮肤淋巴瘤虽具侵袭性，但这些病理类型罕见于儿童［5］。儿童常见的前B淋巴母细胞淋巴瘤/白血病（B?LBL）在骨髓受累之前常侵犯结外部位，最常见皮肤，与前T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病（T?LBL）不同，后者常侵犯淋巴结和纵隔［6］。Kahwash 等［7］报道的6例儿童皮肤LBL均为前B淋巴母细胞表型。本例临床行为呈高度侵袭性，与皮肤损伤同时出现的还有MDS，不好用原发皮肤淋巴瘤解释；以皮肤损伤和MDS首发的B?LBL尚未见报道。髓细胞肉瘤（MS）是由幼稚髓细胞组成的髓外肿块，最常见的受累部位为小肠、骨、皮肤和淋巴结。MS可早于骨髓和外周血的改变，也可与MDS或急性髓细胞白血病（AML）同时存在。一旦骨髓幼稚细胞>30%，即可诊断AML。MS最常见的发病年龄为15岁以下和20-44岁之间。Breccia 等［8］报道，该中心于1995年1月-2000年12月诊治了髓细胞肉瘤12例，占该中心同期AML的2%。诊断时骨髓病态造血7例、骨髓原始细胞30%以上2例、正常骨髓象3例。MS进展至AML的平均时间5个月，平均生存时间7个月。本例发病时的皮肤损伤和骨髓病态造血，以及半年后骨髓75%肿瘤细胞均可用MS的发生演变来解释。还有一个令人困惑的问题，即患儿骨髓原始细胞比例的两次下降。两次均发生于输注红细胞后。这可能与激素的使用有关。对激素敏感的肿瘤细胞多起源于淋系造血细胞，AML也有输血或感染后自行缓解的现象［9］。总之，本例的临床表现更支持肿瘤的髓系来源，而激素部分反应也不能除外淋系可能。有必要鉴定肿瘤细胞的免疫表型。
首先利用流式细胞术分析骨髓幼稚细胞的免疫表型。本例骨髓涂片显示30%原始细胞，满足急性白血病的诊断标准。在免疫分型中，白血病细胞构成比低于形态学结果，为10%。流式细胞术对幼稚细胞的定性分析比定量分析更具有临床意义。本例幼稚细胞群表达CD34、HLA?DR、cMPO、CD33和CD117，具有原始髓细胞表型；同时表达CD2、cCD3、CD5、CD7，并有CD4和CD8的双表达，而无CD3和TdT的表达。WHO建议前T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤（pre?TALL/LBL）的免疫表型为：TdT、cCD3和CD7全表达；CD2、CD3、CD4、CD5、CD8和CD10不同程度表达；髓系抗原CD13和CD33常表达；CD117和cCD79a不常表达；CD4和CD8常双表达［10］。Lewis 等［11］统计19例pre?TALL/LBL免疫表型，结果与WHO有所不同：cCD3、CD5和CD7全表达，TdT和CD3的阳性率分别为73.3%和38.9%；少见CD4+CD8+以及CD13+、CD33+。本例表达cCD3、CD5和CD7，不表达TdT和CD3，有CD4+CD8+，符合pre?TALL/LBL表型。按照EGIL积分标准，本例髓系抗原积分4.0分，T淋系抗原积分4.5分，诊断：双表型急性白血病。
其次利用免疫组织化学法分析皮肤和骨髓活检组织的免疫表型。本例病理诊断有几点困难：第一，免疫组织化学标记过程中组织溶解非常严重，两个实验室重复标记才得到较为理想的结果，这可能与细胞分化度低、抗原修复条件耐受性差有关。第二，解读CD99和CD43阳性的意义。CD99除特征性表达于原始神经外胚层瘤/Ewing肉瘤（PNET/ES）外，也强表达于最早期的幼稚T淋巴母细胞，其次为CD34+CD33+髓细胞和CD34+CD10+早前B淋巴母细胞。这意味着D99虽常作为淋巴母细胞白血病/淋巴瘤的特征性标记之一，但不是其特异性标记。Kang等［12］的研究显示AML有49%表达CD99。CD43常用作T细胞的标志，但无T系特异性。Kennedy 等［13］联合免疫组织化学、流式细胞术和分子遗传学技术分析4例仅CD43阳性而B系标记（CD20、CD79a）和T系标记（CD3、CD5）阴性的可疑淋巴瘤，结果无1例T细胞起源，其中1例髓细胞肉瘤、1例裸细胞间变性大细胞淋巴瘤和2例弥漫大B细胞淋巴瘤。Vodyanik［14］在人胚胎干细胞分化培养的研究中发现：CD43可定义向造血细胞分化的早期胚胎祖细胞。综上所述，CD43和CD99标记最早期造血祖细胞，它们的解读一定要结合其它T系、B系和髓系的标记。本例CD43和CD99强阳性，T系标记CD3和髓系标记MPO灶状阳性，B系标记CD20、CD79a阴性，提示肿瘤细胞可能起源于多能造血干细胞，部分向T淋系和髓系分化。本例骨髓活检组织见灶状CD43阳性细胞团，CD3阳性，并有CD99表达，支持灶性增生细胞为T淋巴母细胞，与流式细胞术检测结果相符。第三，有关双表型淋巴瘤/白血病问题。以往报道的病例是通过流式细胞术检测骨髓细胞确诊的。近两年来，北京大学淋巴瘤病理室通过免疫组化确诊了11例双表型淋巴瘤/白血病，有T/B淋巴细胞双表型、T/粒细胞双表型、B/粒细胞双表型和非T非B/粒细胞双表型（数据未报道）。
根据上述骨髓细胞和皮肤损伤组织的免疫表型，本例明确诊断：双表型急性白血病。除形态和免疫学方法外，细胞分子遗传学技术对于双表型白血病的诊断也是十分必要的。Owaidah等［15］利用EGIL积分标准从676例急性白血病中鉴定出23例（3.4%）BAL，83%的BAL有染色体畸变，最常见t(9;22)(q34;q11)和MLL基因重排，阳性率分别为17%和26%。t(9;22)和MLL基因重排是预后不好的最有力指标［16］。BAL的预后差与其高度的染色体畸变率有关。本例检出MLL PTD，为MLL基因重排的一种［17］，有助于BAL的诊断和预后评估。
近年来利用肿瘤干细胞模型解释肿瘤异质性。该模型认为，恶性肿瘤由大小两群细胞组成，小群细胞具有无限增殖和自我更新潜能，称为肿瘤干细胞，其维持肿瘤的生长；大群细胞为肿瘤干细胞的子代，丧失自我更新，发生定向分化。此模型已从白血病、脑肿瘤和乳腺癌等获得了证据［18］。本例肿瘤细胞强烈表达早期造血细胞标记而灶性表达系特异性标记，支持肿瘤干细胞模型。骨髓增生异常综合征向急性白血病的转化也支持肿瘤干细胞模型。MDS有30%进展至AML，不足1%进展至ALL。Disperati报道［19］了1例并复习先前文献报道的21例MDS向ALL的转化。作者认为，MDS细胞起源于多能造血干细胞，其可向髓系和淋系分化，髓系的优先分化可能与骨髓微环境诱导了MDS子代淋系定向祖细胞的凋亡有关。基于MDS和急性白血病有共同的多能造血干细胞起源，本例MDS作为BAL的前期阶段理论上是可以解释的。本例另一前期表现皮肤损伤，称非白血病期白血病皮疹（aleukemic leukemia cutis），即白血病细胞先于外周血和骨髓的皮肤浸润［20］。这种情况非常少见。如前所述，发生于AML、尤其是M4和M5的白血病皮疹，又称髓细胞肉瘤。Johansson等［21］报道MLL基因重排阳性的儿童AML，特别是小婴儿患者，可以皮肤的髓细胞肉瘤为首发症状。Onozawa等［22］首次报道1例Ph染色体阳性髓系/B淋系BAL的aleukemic leukemia cutis。至于髓系/T淋系的BAL，常见纵隔肿块起病［23］，白血病细胞的皮肤浸润未见报道。
目前尚无髓系/淋系双表型白血病的统一方案。Tiribelli 等［23］报道他们治疗髓系/T淋系BAL的经验：用VDLP方案可诱导缓解，用蒽环类加大剂量阿糖胞苷可维持缓解。本例虽有MLL的串联重复，但发病年龄>1岁，化疗效果应还可以。病程早期的激素反应即可说明这点。诱导缓解采用VDLP方案。患儿于化疗1周皮肤损伤消退，第21天骨髓幼稚细胞消失，三联鞘注1次后脑脊液中白血病细胞消失。但正常造血迟迟未恢复，提示白血病细胞有可能在短期内死灰复燃。诊断治疗的延误可能影响了患儿的化疗效果。
综上所述，本例双表型急性白血病以皮肤损伤和骨髓增生异常综合征为前期表现，诊断时合并脑膜白血病。肿瘤细胞除同时表达髓系和T淋系标记外，强烈表达最早期造血祖细胞标记CD43和CD99，检测到MLL基因的部分串联重复。提示：本例白血病细胞可能起源于多能造血干细胞，临床和生物学行为具有高度侵袭性。免疫表型、细胞遗传学和分子特征有助于这类疾病的早期诊断和预后评估。
致谢：感谢北京大学医学部淋巴瘤病理室高子芬教授和首都医科大学附属北京儿童血液中心李志刚助理研究员的指导和帮助。
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