腺病毒介导PDCD5基因转移促进依托泊甙诱导的K562细胞凋亡
作者：阮国瑞， 陈珊珊， 常艳， 李金兰， 秦亚溱， 李玲娣， 郝乐， 付家瑜， 刘艳荣， 黄晓军
【摘要】 本研究观察程序性细胞死亡5基因（programmed cell death 5， PDCD5）重组腺病毒转染K562细胞后对化疗药物依托泊甙的增敏作用。 利用AdMaxTM腺病毒载体包装系统，通过同源重组方法构建Ad?PDCD5重组腺病毒及对照腺病毒Ad?null及Ad?eGFP；用不同感染复数将Ad?eGFP、Ad?null或Ad?PDCD5转染人白血病细胞系，实时定量PCR检测PDCD5 mRNA的相对表达水平；利用MTT法及Annexin?V?FITC/PI双染色流式细胞术观察依托泊甙对转染后K562细胞增殖与凋亡的影响。结果表明： Ad?eGFP腺病毒对白血病细胞系K562、Jurkat及CEM的转染效率可达60%-86%。Ad?PDCD5重组腺病毒能梯度增加K562细胞PDCD5 mRNA的相对表达水平，腺病毒介导的PDCD5基因转移促进依托泊甙诱导的K562细胞凋亡。结论： PDCD5重组腺病毒可能成为化疗药物的增敏剂。
【关键词】 腺病毒
Adenovirus?mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes Apoptosis of K562 Cells Induced by Etoposide
Abstract This study was purposed to investigate the effect of adenovirus?mediated transfer of PDCD5 gene on apoptosis of K562 cells induced by etoposide. Recombinant adenovirus PDCD5 (Ad?PDCD5), control vectors Ad?null and Ad?eGFP were constructed by AdMaxTM vector system respectively. After K562 cells were transfected by Ad?PDCD5, Ad?null or Ad?eGFP with different multiplicity of infection (MOI), the expression level of the PDCD5 gene was examined by RQ?RT?PCR assay. The effects of etoposide in combination with Ad?PDCD5 on the proliferation and apoptosis of K562 cells were measured by using MTT assay and flow cytometry with Annexin?V?FITC/PI dual labeling technique, respectively. The results showed that the transfection efficiencies of Ad?eGFP in K562, Jurkat and CEM cells ranged from 60% to 86%. Expression level of PDCD5 gene in K562 cells was evidently increased following transfection with Ad?PDCD5. The Ad?PDCD5 synergistically enhanced the apoptotic percentage of K562 cells induced by VP?16, as compared with that of Ad?null+VP16 and VP?16 alone respectively. It is concluded that Ad?PDCD5 may be a potential agent for enhancing the chemotherapy effect.
Key words adenoviruses； PDCD5； etoposide; K562 cell line； apoptosis； gene transfer
TF?1 细胞凋亡相关基因（TF?1 cell apoptosis?related gene 19，TFAR19）是1999年发现的一种新的凋亡调控基因（GenBank登记号为AF014955）［1］，国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5 (programmed cell death 5)，将含PDCD5 cDNA 的真核表达载体转染白血病细胞系TF?1等细胞后，可加速这些细胞的凋亡。已发现PDCD5在白血病细胞系Jurkat凋亡过程中发挥作用［2］，人重组PDCD5蛋白对白血病细胞系HL?60具有促凋亡作用［3］，人重组PDCD5蛋白对化疗药物羟基喜树碱诱导的肝癌细胞凋亡也具促进效应，并且显示了明确的量效关系［4］。在本实验中，我们对构建的PDCD5重组腺病毒进行了鉴定、扩增和纯化，观察了其对白血病细胞系的转染效率及感染人慢性髓系白血病细胞系K562后，对依托泊甙（Etoposide，即足叶乙甙Vepe?side，VP?16）诱导的凋亡的影响，旨在为PDCD5作为化疗增敏剂提供实验依据。
材料和方法
人慢性髓系白血病细胞系K562和急性淋巴细胞白血病细胞系CEM、Jurkat由本室保存。以含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液（美国Gibco公司产品）于37℃、5% CO2孵箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
PDCD5重组腺病毒的构建、鉴定及纯化
利用加拿大AdMaxTM腺病毒载体包装系统，由本元正阳基因有限公司完成PDCD5重组腺病毒的构建，其中PDCD5基因表达盒由CMV启动子、PDCD5 cDNA和SV40 polyA信号序列构成，并插入到缺失了E1和E3区的腺病毒基因组的E1区中，构建过程如下：用限制性内切酶EcoR V和Hind III切下pcDI?PDCD5质粒（由北京大学人类疾病基因研究中心马大龙教授提供，经过测序验证）［1，5］中的目的基因，用限制性内切酶Sma I和Hind III切开pDC316质粒，将目的基因插入，构建成pDC316?PDCD5，进行酶切鉴定之后，该质粒与基因组质粒共转染ATCC 293细胞包装成Ad?PDCD5重组腺病毒，并进行扩增鉴定，其引物序列为：上游 5' ATGGCGGACGAGGAGCTTG 3'；下游5' TCAATAATCGTCATCTTCATCAG 3'。 扩增条件为：94℃ 5分钟，然后 94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，30个循环，最后72℃ 7分钟。扩增产物存于4℃冰箱，用常规方法进行电泳。对照病毒Ad?eGFP（含增强型绿色荧光蛋白基因green fluorescent protein， GFP）和Ad?null（不含目的基因的空载体）用同样方式构建。病毒繁殖、纯化及活性检测 (组织培养半数感染量，TCID50)按本元正阳基因有限公司常规方法进行。
重组腺病毒转染效率的测定
将Ad?eGFP按不同的感染复数 (multiplicity of infection, MOI) 感染细胞, 倒置荧光显微镜下观察。48小时后离心收集细胞，用PBS洗涤，上流式细胞仪（FACSort型，美国Becton Dickinson公司产品）检测并阳性细胞百分率。
PDCD5表达的相对水平的实时定量PCR检测
实时定量PCR检测不同MOI Ad?PDCD5感染K562细胞PDCD5表达的相对水平，利用TaqMan 技术在ABI 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA) 完成。PCR 条件是 50℃ 2 分钟; 95℃ 10 分钟；接着是95℃ 15秒；60℃ 1分钟，共50 个循环, PCR 反应体系及引物序列参见［6］。 以K562细胞cDNA 10倍稀释所获ABL及PDCD5基因扩赠标准曲线方程分别为log ABL=(Ct?21.29)/?3.42（r=0.99）、log PDCD5=(Ct?18.68)/?3.51（ r=0.99）。K562细胞感染（不同MOI 的Ad?PDCD5或Ad?null）后，分别收集细胞，提取总RNA并制备成cDNA（参照本室常规进行），实时定量PCR扩增后的ABL及PDCD5的Ct值分别代入上述标准曲线方程进行计算，以PDCD5/ABL比值代表PDCD5表达的相对水平。
Ad?PDCD5与VP?16协同作用的流式细胞术测定
取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，分别以MOI 400、800、1600、3200感染Ad?null及Ad?PDCD5，72小时后离心收集细胞， 用PBS洗涤2次， 按Annexin? V?Fluos试剂盒（北京宝赛公司）说明进行标记，以K562细胞为对照，流式细胞仪(FACSort型，美国Becton Dickinson公司)上检测红色（PI，DNA）和绿色（Annexin? V，FITC）荧光强度。两者均阴性细胞为活细胞，FITC 阳性、PI阴性细胞为早期凋亡细胞，两者均阳性细胞为晚期凋亡细胞， FITC 阴性、PI阳性细胞为死亡细胞。根据FCM散点图，以对照管设门，计算凋亡细胞所占百分比。
取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，以MOI 200分别感染Ad?null及Ad?PDCD5，感染24小时后，分别加入0.5 μg/ml的 VP?16，作用24小时后离心收集细胞，按上述操作上机并计算凋亡细胞所占百分比。
Ad?PDCD5与VP?16协同作用的MTT测定
取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，分为6组，以MOI 200分别感染Ad?null及Ad?PDCD5 各2组，另2组K562细胞作为对照。24小时后以0.5 μg/ml的VP?16分别处理K562、Ad?null及Ad?PDCD5各1组，细胞接种于96孔板，100 μl/well，培养0、24、48小时加入MTT工作液 （5 mg/ml），每孔20 μl，继续培养4小时后，加入10% SDS?0.01N HCl溶解细胞，570 nm波长（Bio?Rad 650型酶标仪）下测定吸光度（A）值，每时间段每样品测定5孔求平均值。
细胞增殖率=A24（48）h -A0h / A0h
统计学处理
利用SPSS软件，进行单因素方差分析多重比较，再进行Bonferroni Post Hoc Tests校验。
结 果
Ad?PDCD5重组腺病毒的鉴定及纯化
pDC316?PDCD5质粒酶切（EcoR I）鉴定电泳图见图1，与pcDI?PDCD5阳性对照质粒相比，构建的pDC316?PDCD5质粒均可切出目的基因片段。Ad?PDCD5重组腺病毒的鉴定见图2。电泳结果表明，随机挑取的11个单斑的细胞培养上清和细胞裂解液均扩增出与目的基因相符的片段，293细胞和无外源基因的腺病毒均无扩增产物，说明pDC316?PDCD5在293细胞中已完成重组出腺病毒，已筛选出含有目的基因的重组腺病毒Ad?PDCD5。Ad?PDCD5及Ad?null毒种各生产50个125 cm2培养瓶病毒，收获的病毒经纯化后进行质检，高效液相色谱法测二者纯度均达到98%以上，Ad?null及 Ad5?PDCD5的产品滴度分别为： 6.3×1010 TCID50/ml及2.2×1010 TCID50/ml。
Ad?eGFP腺病毒对白血病细胞转染效率测定（48小时 ）
随着MOI增加，Ad?eGFP腺病毒感染白血病细胞系K562、Jurkat及CEM 48小时后，均可见其转染效率依次增加。MOI 20时K562、Jurkat及CEM细胞转染效率分别为28.4%、41.3%及26.2%；MOI 100时其转染效率分别为55.7%、82.8%及36.5%；MOI 200时其转染效率分别为64.9%、85.8%及58.6%；MOI 400时其转染效率分别可达71.2%、86.6%及65.5%。
感染Ad?PDCD5对K562细胞Ad?PDCD5表达水平的影响
以K562细胞PDCD5/ABL表达水平为1，则不同MOI的Ad? PDCD5感染K562细胞48小时后，与感染Ad?null相比，K562细胞PDCD5的表达均增加，随着MOI 从200、400、800增加至1600，Ad? PDCD5/ABL从1.6、3、8倍增加至12倍（表1）。
不同MOI感染Ad?PDCD5对K562细胞的影响
用MOI为400、800、1600、3200的Ad?PDCD5感染K562细胞72小时后，存活细胞依次为86.8%、89.4%、87.0%、84.8%；与不感染（87.2%）或感染Ad?null（依次为86.7%、88.0%、90.0%、86.3%）相比没有明显差别。
Ad?PDCD5与VP?16的协同作用
以MOI 200分别感染Ad?null及Ad?PDCD5 24小时后，分别加入0.5 μg/ml的 VP?16。结果显示，VP?16 0.5 μg /ml作用24小时，Ad?PDCD5加VP?16处理的K562细胞与对照组相比有更多的凋亡，对照细胞、Ad?null、Ad?PDCD5、VP?16 0.5 μg /ml、Ad?null+VP?16 0.5 μg /ml及Ad?PDCD5+VP?16 0.5 μg/ml的凋亡率依次为11.7%、14.4%、13.1%、30.4%、29.6%、49.3%（图3）。
Figure 3. Apoptosis of K562 cells induced by VP?16 following co?treating with Ad?PDCD5 by flow cytometry assay. Results indicated that Ad?PDCD5 synergistically enhance the apoptotic rate of K562 cells induced by VP?16 as compared with that of Ad?null+VP16, and VP?16 alone, respectively.
Ad?PDCD5与VP?16的协同作用
与K562或感染Ad?null的K562细胞相比，感染Ad?PDCD5的K562细胞24或48小时时细胞增殖率没有明显差别。24小时时对照组、Ad?null及Ad?PDCD5组细胞增殖率分别为73.9%、69.8%、78.0%；48小时时分别为146.6%、151.4%、142.2%。但在0.5 μg/ml VP16作用下，感染Ad?PDCD5的K562细胞增殖率比对照组明显下降，甚至出现负增殖。24小时时VP16、Ad?null+ VP16及Ad?PDCD5+ VP16细胞增殖率分别为57.3%、53.0%、23.8%；48小时时分别为26.5%、23.3%、?10.0%（表2）。
讨 论
腺病毒载体系统是目前运用最广的病毒载体之一，它被广泛用于基因、基因功能性研究、反义治疗、疫苗开发等领域。AdMaxTM腺病毒系统，是由腺病毒载体鼻祖Dr. Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是通过Cre?loxP或FLP?frt重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和辅助质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。在本实验中，我们利用该系统构建了PDCD5重组腺病毒并进行了鉴定、扩增和纯化，结果显示Ad?eGFP腺病毒感染白血病细胞系K562、Jurkat及CEM 48小时后转染效率高，Ad?PDCD5腺病毒感染K562细胞后能高水平表达PDCD5，病毒经繁殖、纯化后获得了很高的滴度（TCID50达到1010/ml以上），以MOI为400、800、1600、3200的Ad?PDCD5感染K562细胞72小时后，存活细胞均可达到85%以上，与不感染或感染Ad?null相比没有明显差别，我们进一步应用流式细胞术及MTT实验观察了Ad?PDCD5与VP?16对K562细胞的协同作用，结果发现，与感染Ad?null相比，感染Ad?PDCD5的K562细胞对VP?16诱导的凋亡更敏感，Ad?PDCD5+VP?16组凋亡细胞比VP?16或Ad?null+VP?16组增加近20%。MTT实验显示，与K562或感染Ad?null的K562细胞相比，感染Ad?PDCD5的K562细胞24小时或48小时时细胞增殖率没有明显差别，但在VP16作用下，感染Ad?PDCD5的K562细胞增殖率比对照组明显下降，甚至出现负增殖，24小时或48小时时增殖率下降30%左右。张颖妹等［3］发现，人重组PDCD5蛋白对白血病细胞系HL?60具有促凋亡作用，不同质量浓度的人重组PDCD5蛋白对化疗药物羟基喜树碱诱导的肝癌细胞凋亡也具促凋亡效应［4］。我们的实验结果证明，感染Ad?PDCD5的K562细胞能提高PDCD5的表达水平，并能增加对化疗药物VP16的敏感性，PDCD5重组腺病毒可能成为化疗药物的增敏剂。
【】
1Liu H, Wang Y, Zhang Y, et al. TRAR19, a novel apoptosis?rela? ted gene cloned from human leukemia cell line TF?1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophy Res Commun,1999; 254：203-210
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