抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

           作者：陈书成, 刘雅坤, 吴小华，单保恩, 陈兴, 孙东霞, 王莉

【关键词】  间皮素;,可溶性间皮素相关蛋白;,B细胞表位;,单克隆抗体

　　Preparation and characterization of the monoclonal antibody against human soluble mesothelinrelated proteins

　　Department of Obstetrics and Gynaecology, the Fourth Hosipital of Hebei Medical University, Research Center of  the Fourth Hosipital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011; Bethune International Peace Hosipital, Shijiazhuang 050000, China

　　[Abstract]  AIM: To prepare the monoclonal antibody (mAb) against human  soluble mesothelinrelated proteins (SMR) and identify its properties. METHODS: The Bcell epitopes of mesothelin (MSLN) were predicted by multiparameter prediction method. Then BALB/c mice were immunized with compound MSLN polypeptide prepare the mAb by hybridoma technique. The specificity of antibody was evaluated by immuocytochemistry and Western blot respectively. RESULTS: Using the multiparameter prediction of Bcell epitopes, the 471-481 epitope domain was selected and synthesized. Then the mice were immunized and mAb against human SMR was prepared and designated 2H10. The specificity of mAb 2H10 was evaluated to be high by using immuocytochemistry and Western blot. CONCLUSION: The successful preparation of the mAb against SMR will provide efficient  reagent for further detection of SMR by ELISA.

　　[Keywords]mesothelin; soluble mesothelinrelated proteins; Bcell epitopes; monoclonal antibody

　　[摘 要]  目的: 制备鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白（SMR）的单克隆抗体(mAb), 鉴定其生物学特性。方法: 应用机通过综合预测对间皮素(MSLN)进行B细胞表位预测。合成相应肽段并免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb, 利用免疫细胞化学和Western blot分析对所制备的mAb进行鉴定。结果: 综合预测方法分析间皮素的抗原表位可能于153-162、 282-292及471-481氨基酸残基或其附近, 选择性合成了可能性最高的位于471-481氨基酸残基的可溶性间皮素相关蛋白表位, 制备了mAb (2H10), 经免疫细胞化学和Western blot分析该抗体具有较高的特异性。结论: 成功地制备了鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白的mAb（2H10）, 该抗体具有较高的特异性, 为进一步利用ELISA对可溶性间皮素相关蛋白进行检测奠定了基础。

　　[关键词]间皮素; 可溶性间皮素相关蛋白; B细胞表位; 单克隆抗体

　　间皮素（mesothelin, MSLN）是一种相对分子质量（Mr）约为40000的细胞表面糖蛋白, 在间皮瘤、 卵巢癌、 胰腺癌等恶性肿瘤中高表达[1, 2]。间皮素cDNA编码Mr为69000的前体蛋白, 糖基化后被蛋白酶水解为40000和31000的片段, 其中40000的片段通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol）与胞膜相连, 称为间皮素; Mr 31000的片段脱落后称为巨核细胞集落刺激因子(megakaryocytepotentiating factor)[2]。间皮素包括两个异构体, 其中异构体2由于保留了第16和17外显子间的内含子, 使其蛋白翻译提前终止, 从细胞表面脱落形成可溶性间皮素（solublemesothelinrelatedproteins,SMR）,Mr为42000～45000[3]。癌组织中间皮素阳性表达的恶性肿瘤患者, 其血清和腹水中可以检测到SMR的存在, 从而使之有可能成为新的恶性肿瘤监测指标[4]。但到目前为止, 国内仍无可以检测SMR的ELISA试剂盒。基于这一目的, 本研究中选择性地合成了鼠抗人SMR的多肽制备其单克隆抗体（mAb）, 并对其生物学特异性进行了鉴定。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  GOLDKEY核酸和蛋白质分析软件及核酸和蛋白质数据库光盘, 由军事医学院基础研究所提供。卵巢浆液性囊腺癌细胞系OVCAR3、 浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3及卵巢上皮性癌细胞系3AO均为本院科研中心冻存。Sp2/0骨髓瘤细胞株为解放军国际和平试验中心冻存。BALB/c小鼠(鼠龄6～8周, 质量18～25 g)购自河北医科院实验动物中心。DMEM培养基、 RPMI1640培养基为美国GIBCO公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。小鼠SP检测和DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥公司。蛋白提取试剂盒和protein marker为赛百盛公司产品。考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品, mAb分型试剂盒购于美国Boehriger公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  单参数预测、 综合预测及抗原肽合成  应用GOLDKEY软件分析间皮素氨基酸序列全长, 应用4个主要参数: Hopp & Woods亲水性参数（Hydrophilicity）, Welling抗原性参数（Antigenicity）, 可及性参数（Accessibility）和二级结构（The secondary structures）对抗原表位分别进行单参数预测, 均高于域值的峰为预测出的位点。其中间皮素氨基酸序列全长如下:

　　1 malptarpll gscgtpalgs llfllfslgw vqpsrtlage tgqeaapldg vlanppniss

　　61 lsprqllgfp caevsglste rvrelavala qknvklsteq lrclahrlse ppedldalpl

　　121 dlllflnpda fsgpqactrf fsritkanvd llprgaperq rllpaalacw gvrgsllsea

　　181 dvralgglac dlpgrfvaes aevllprlvs cpgpldqdqq eaaraalqgg gppygppstw

　　241 svstmdalrg llpvlgqpii rsipqgivaa wrqrssrdps wrqpertilr prfrrevekt

　　301 acpsgkkare ideslifykk weleacvdaa llatqmdrvn aipftyeqld vlkhkldely

　　361 pqgypesviq hlgylflkms pedirkwnvt sletlkalle vnkghemspq aprrplpqva

　　421 tlidrfvkgr gqldkdtldt ltafypgylc slspeelssv ppssiwavrp qdldtcdprq

　　481 ldvlypkarl afqnmngsey fvkiqsflgg aptedlkals qqnvsmdlat fmklrtdavl

　　541 pltvaevqkl lgphveglka eerhrpvrdw ilrqrqddld tlglglqggi pngylvldls

　　601 mqealsgtpc llgpgpvltv lalllas
   
　　综合预测采用抗原性指数分析曲线[5]与上述单参数方法对照, 以避免一种预测方法所造成的误差。抗原肽的合成: 利用酪氨酸具有两个氨基的特殊结构, 先合成具有4个氨基末端的酪氨酸核心, 肽链从C端向N端延伸, 以每个氨基为起点按预先选定的氨基酸序列合成（由北京宣武医院多肽实验室ABI433A型多肽自动合成仪合成）。

　　1.2.2  鼠抗人SMR mAb的制备  应用硝酸纤维素膜剪成02×05 cm, 在含SMR复合肽抗原的溶液中浸泡过夜, 应用包埋法背部皮下免疫BALB/c小鼠。分别于初次免疫后14 d、 28 d后进行两次加强免疫, 方法同第1次, 末次免疫后3 d, 在无菌条件下取出脾脏, 研磨使脾细胞游离, GKN缓冲液洗涤, 1000 r/min离心5 min, 弃上清, 重复离心1次, 沉淀的细胞用10 mL无血清DMEM培养液重悬。将骨髓瘤细胞Sp2/0在1 g/L与脾细胞按1∶7的比例PEG作用下按常规方法融合。用间接ELISA法检测各孔产生抗SMR抗体的阳性克隆。对阳性克隆细胞采用限界稀释法进行单克隆培养。抗体的大量制备采用小鼠腹腔注射法。先于BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡, 2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞, 接种细胞10 d后收集腹水, 离心取上清液,冻存于冰箱。

　　1.2.3  mAb的效价及亚类鉴定  （1）效价测定: 利用SMR复合肽抗原(1 μg/L)1∶1000稀释包被微孔板,  利用ELISA法检测抗体效价。(2)抗体亚类测定: 用mAb亚类分型试剂盒, 按试剂盒说明书操作。

　　1.2.4  特异性鉴定  (1)SP免疫细胞化学法: 盖玻片放置于无菌6孔培养板中, 加入对数生长期的人卵巢癌细胞系OVCAR3、 SKOV3、 3AO, 制成细胞爬片。采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶（SP）连接法, 检测制备的mAb与天然蛋白反应的特异性。以胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。以上实验重复3次。(2)Western blot检测mAb的特异性: 分别收取OVCAR3、 3AO、 SKOV3等3组细胞,  用蛋白提取试剂盒收取细胞蛋白, 考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒对收取的各组蛋白进行定量, 取等量蛋白（50 μg）行SDSPAGE电泳, 将蛋白转移至PVDF膜上, 加入一抗[分别为鼠抗人间皮素mAb（克隆号K1, 美国ZYMED公司产品, 稀释度为1∶150）和制备的mAb 2H10（稀释度为1∶200）]。空白对照以PBS代替一抗。以上实验重复3次。

　　2  结果

　　2.1  人间皮素B细胞抗原表位的多参数预测和抗原肽合成  高于预测域值的氨基酸残基所对应的肽段即为预测的抗原表位。应用不同预测方法所预测的多个抗原表位个数和抗原表位可能出现的肽段的位置有所不同, 但在氨基酸序列153-162、 282-292及471-481等3个肽段, 多种预测方法所预测的结果一致, 有较好的亲水性和可及性, 在二级结构上含有易形成抗原表位的不规则卷曲和β转角结构。因此, 间皮素的B细胞抗原表位可能位于此区域或它们附近。其中297-600氨基酸序列为SMR, 我们选择合成了间皮素分子N末端氨基酸残基471-481片段, 含有11个氨基酸残基, 顺序为QDLDTCDPRQL。对人间皮素序列中N末端471-481的11个氨基酸残基进行了短肽合成, 将抗原肽与KLH结合形成复合肽抗原, 为淡黄色固体, 用1 mg免疫小鼠。

　　2.2  鼠抗人SMR mAb的制备  应用SMRKLH作为免疫原, 采用皮下包埋法多次免疫小鼠, 获得了分泌抗SMR抗体的小鼠脾细胞, 在PEG的诱导下小鼠脾细胞能较好的与Sp2/0骨髓瘤细胞在体外进行融合, 形成杂交瘤细胞株, 经间接ELISA法, 筛选出抗SMR多肽抗体的杂交瘤细胞2株, 分别为2H10、 6D9, 经反复传代和冻融, 能稳定分泌抗体的2H10株, 扩大培养, 制备小鼠腹水, 产生抗SMR mAb, 抗体效价为1∶102400。mAb（2H10）的IgG亚类为IgG1(重链), 轻链为κ链。

　　2.3  mAb的特异性鉴定  (1)免疫细胞化学SP法检测结果: 经市售抗间皮素抗体（5B2）证实, 卵巢癌细胞系OVCAR3、 SKOV3、 3AO均为间皮素阳性。本试验制备的抗SMR抗体2H10可以与上述3种细胞反应, 均在细胞膜上可见明显的棕黄色颗粒沉着（图1）。(2)Western blot检测结果: 对多肽经SDSPAGE分析用商售抗间皮素抗体K1和分别染色均在抗体2H10 Mr在40000左右得到单一条带（图2）。

　　图1  鼠抗人间皮素mAb特异性分析的免疫细胞化学检测（略）

　　Fig 1  Analysis of specificity of mice mAb against MSLN by immunocytochemistry (×400)

　　A: 5B2+OUCAR3; B: 5B2+SKOV3; C: 5B2+3AO; D: 2H10+OUCAR3; E: 2H10+SKOV3; F: 2H10+3AO.

　　图2  鼠抗人间皮素抗体2H10特异性的Western blot检测（略）

　　Fig 2  Western blot analysis of specificity of mice mAb 2H10 against SMR

　　A: The reactivity of K1; B:The reactivity of 2H10. M: Protein marker; 1: The lane of OVCAR3 protein; 2: The lane of SKOV3 protein; 3: The lane of 3AO protein.

　　3  讨论

　　正常组织细胞发生恶性转化会出现新的遗传表型及与之相应的分子转变, 这些变化不仅使恶性细胞获得了与正常细胞不同的生长特性, 也为我们寻找新的肿瘤标记物和药物靶点提供了线索。本研究的前期工作中, 用cDNA微阵列方法分析了卵巢上皮性癌和正常卵巢皮质的基因表达谱, 发现间皮素基因是卵巢上皮性癌组织中表达上调最显著的基因。间皮素是由mAb K1在间皮细胞、 间皮瘤、 卵巢上皮性癌、 胰腺癌等组织细胞中识别的抗原[4]。间皮素包括两个异构体, 异构体2保留了第16和17外显子间的内含子使其蛋白翻译提前终止,  从细胞表面脱落形成可溶性间皮素相关蛋白（SMR）Mr为42000～45000。McIntosh等[5]同时检测卵巢癌患者血清CA125和SMR在诊断和病情监测上优于单纯的CA125检测。然而目前尚且没有市售的纯天然SMR。研究中针对SMR制备的抗体多通过细胞免疫或质粒转染产生的蛋白免疫[6]。多肽抗原表位成分单一, 结构简单, 引发的反应针对性强, 我们采用蛋白抗原表位预测, 应用GOLDKEY核酸和蛋白质分析软件, 选取4种预测参数对间皮素的抗原表位进行预测。①亲水性参数: 疏水性氨基酸残基一般埋在蛋白内部, 而亲水性残基位于表面, 因此, 蛋白质的亲水部位与蛋白的抗原位点有密切的联系。②抗原性参数:一般认为, 除亲水性氨基酸残基外, 疏水性氨基酸残基也经常出现在表位中, 各残基在蛋白抗原位点中的相对出现率对抗原表位的定位预测有一定意义。③可及性参数: 蛋白抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性, 它反映了蛋白抗原内、 外各层各残基的分布组成。④二级结构预测: 有资料表明, 抗原决定簇多定位在高亲水性参数与转角出现一致的区域。转角结构为凸出结构, 多出现在蛋白抗原表面, 利于与抗体嵌合, 较可能成为抗原表位。同时进行蛋白二级结构β转角预测, 根据上述参数的权重的不同, 建立多参数综合表位预测模型, 提高预测的吻合率。本研究中预测结果显示在氨基酸序列153-162、 282-292及471-481这3个肽段显示出多种预测方法所预测的结果一致, 我们选择了其中N末端氨基酸残基471-481片段（含11个氨基酸残基）制备了多肽抗原。由于多肽抗原Mr较小, 免疫原性较低在体内易被降解。故我们将表位多肽与大分子物质KLH偶联, 应用预测的抗原多肽成功地制备了抗SMR mAb, 通过免疫细胞化学、 Western blot等方法[7]与市售的抗间皮素抗体K1、 5B2进行对比, 证实了预测的正确性。所制备的抗间皮素mAb可进一步建立检测SMR的ELISA试剂盒, 将应用于卵巢癌等间皮素表达阳性的肿瘤的诊断及病情监测。

　　:

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　　[4] Scholler N, Fu N, Yang Y, et al. Soluble member(s) of the mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family are detectable in sera from patients with ovarian carcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(20): 11531-11536.

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