牛IL
作者：田兆菊, 郑玉姝, 胡敬东, 赵宏坤
【关键词】 BoIL
[摘 要] 目的: 在杆状病毒表达载体中表达牛白细胞介素18(bovine interleukine18, BoIL18)成熟蛋白基因, 并鉴定其生物学活性。方法: 设计一对特异性引物, 将编码BoIL18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb上, 构建重组质粒repFastBac HTb18, 转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid（BacmidBoIL18）。在Cellfectin作用下, 将BacmidBoIL18转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒, 然后将重组杆状病毒感染sf9, 感染后不同时间收获sf9细胞, 进行SDSPAGE电泳, 分析表达情况; 用BoIL18的原核表达产物作为抗原制备的兔多克隆抗体进行Western blot分析; 将纯化的表达产物对牛外周血单个核细胞（PBMC）进行细胞增殖试验, 对健康牛脾进行IFNγ诱生试验, 初步分析表达产物的生物学活性。结果: BoIL18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达, 经薄层凝胶扫描分析证实, 表达量占总蛋白的213%; Western blot分析证明, 在相对分子质量（Mr）约为26000处有一条特异性条带。生物学活性分析表明, 纯化的表达产物可明显增强淋巴细胞增殖, 促进IFNγ的产生。结论: BoIL18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达, 表达产物具有良好的生物学活性。
[关键词]BoIL18成熟蛋白基因;杆状病毒表达载体系统; 昆虫细胞; 生物学活性
白细胞介素18(IL18)是Okamura等[1]首次从小鼠肝脏中克隆获得的,除能强烈地诱导免疫细胞释放IFNγ、 GMCSF、 TNFα等多种细胞因子外, 也具有增加FasL 的表达以及增强NK细胞毒性作用等多种生物学效能, 在免疫调节、 抗感染及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用[2]。杆状病毒表达载体系统是最具有应用前景的真核表达系统之一。它具有对外源基因容量大, 操作方便、 不污染环境等优点, 并且能使表达产物得到充分地翻译后修饰。本实验室已经构建了牛白细胞介素18(BoIL18)的重组质粒PMDTBoIL18, 在此基础上设计一对特异性引物, 通过PCR扩增, 将BoIL18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒表达载体, 通过转染昆虫细胞sf9, 得到了BoIL18的高效表达产物; 经对牛PBMC的增殖与对脾IFNγ的诱生试验证实, 表达产物具有良好的生物学活性, 为进一步研究及应用BoIL18提供了实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 昆虫杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac HTb由哈尔滨兽医研究所童光志教授惠赠; DH10Bac、 草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda 9, sf9）由山东农业大学动物科技学院崔治中教授惠赠; 重组牛白细胞介素18（PMDTBoIL18）由本实验室构建并保存; 抗BoIL18的多克隆抗体是由本实验室用纯化的BoIL18的原核表达产物免疫兔制备; DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程公司; 各种限制性内切酶、 T4 DNA 连接酶、 rTaq酶等购自TaKaRa公司; Sf900 II SFM无血清培养基、 Cellfectin转染试剂均购自Invitrogen公司; NiNTA纯化预装柱购自北京卓冠科技有限公司; 羊抗兔IgG、 MTT购自Sigma公司; bIFNγ ELISA包被抗体与检测抗体购自Mabtech公司; 淋巴细胞分离液购自上海生化试剂厂。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与PCR 扩增 根据已发表序列设计一对引物, 委托上海生物工程公司合成, 对BoIL18的成熟蛋白基因进行PCR扩增。序列如下: 上游引物(P1): 5′TATCCATGGATCACTTTGGCAAACTTGAAC3′, 带有Nco I酶切位点及起始密码子; 下游引物(P2): 5′ATCGAATTCCTAGTTCTGGTTTTGAACAGT3′, 带有EcoR I酶切位点及终止密码子。PCR反应条件为: 95℃ 5 min, 充分变性后进入循环体系: 94℃ 45 s, 60℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35个循环, 然后72℃延伸8 min。
1.2.2 重组转移载体的构建及鉴定 将回收纯化的PCR产物和转移载体pFastBac HTb分别用Nco I与EcoR I进行双酶切, 回收BoIL18基因片段及线性化的pFastBac HTb, 用T4 DNA连接酶连接, 构建重组转移载体repFastBac HTb BoIL18, 转化至DH5α, 挑取单菌落, 提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定, 并委托上海生物工程公司进行序列测定, 用DNAStar软件分析插入片段的正确性。
1.2.3 重组Bacmid的构建、 鉴定 将鉴定正确的重组质粒repFastBac HTb BoIL18纯化后转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中, 并涂于含有Xgal 和IPTG的筛选平板（含卡那霉素、 庆大霉素、 四环素三种抗生素）上, 分别挑取白色与蓝色菌落, 根据BactoBac表达系统的说明书提取重组质粒BacmidBoIL18与Bacmid质粒, 用M13上下游引物进行PCR鉴定。
1.2.4 转染及收获重组杆状病毒 将BacmidBoIL18、 Bacmid及Cellfectin分别与100 μL Sf900 II SFM无血清培养基（不含抗生素）混匀; 取生长良好的Sf9单层细胞, 弃去旧培养液, 用SFM培养基洗2 次, 将BacmidBoIL18Cellfectin、 BacmidCellfectin覆盖细胞, 置28℃培养5 h, 取出培养瓶, 弃去旧培养液, 加入含双抗的SFM培养基, 继续培养, 至细胞出现病变后, 收集细胞上清, 即为第1代病毒液, 参照[3]介绍的方法提取重组病毒DNA, 用M13的上下游引物进行PCR扩增, 含有目的片段的即为重组杆状病毒。
1.2.5 BoIL18在sf9昆虫细胞中的表达及Western blot分析 将杆状病毒与重组杆状病毒的第1代病毒液按1∶10体积比接入对数生长期的sf9, 28℃培养, 分别在24、 48、 72、 96、 120、 144 h收获细胞及其上清, 超声波破碎细胞, 离心后取裂解上清及沉淀, 按常规方法处理, 进行SDSPAGE电泳, 分析表达情况。并用相同的方法处理正常Sf9 细胞, 作为阴性对照。凝胶脱色后用薄层凝胶扫描分析仪对表达产物进行分析, 测定表达产物的相对含量。Western blot分析, 参照文献[4]介绍的方法进行: 将SDSPAGE凝胶上的条带转移到硝酸纤维素膜上, 用50 g/L脱脂乳封闭, 用BoIL18的原核表达产物制备的兔多克隆抗体作为一抗, 以1∶5000倍稀释的羊抗兔IgG(碱性磷酸酶标记)作为二抗, 经NBT/BCIP显色, 观察特异性条带。
1.2.6 BoIL18融合蛋白的纯化 收获表达重组BoIL18的sf9细胞, 经超声波破碎后, 于4℃、 5000 g离心10 min, 收集上清, 0.45 μm滤膜过滤后加入预先用PBS（pH7.4）平衡的NiNTA柱, 然后用平衡液洗脱至与基线平, 最后用洗脱液洗脱即可, 用紫外分光光度计检测纯化蛋白的浓度。
1.2.7 BoIL18融合蛋白对PBMC的增殖试验 参照文献[5]介绍的MTT法检测。用淋巴细胞分离液分离健康牛PBMC, 用100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×109 /L, 加入96孔板中。将细胞分成4组, 除细胞对照组与RPMI1640空白组外, 另外2组分别加入20 mg/L ConA、 10 mg/L纯化的重组BoIL18蛋白+ConA, 每组设5个复孔。于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养72 h后, 每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 继续培养4 h, 然后加入DMSO, 于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养2 h, 在酶标仪上读取A570值, 结果以增殖指数（PI）表示。
1.2.8 BoIL18融合蛋白促进IFNγ的产生试验 用双抗体夹心ELISA法测定。取健康牛脾, 参照文献[6]介绍的方法制备脾淋巴细胞, 用100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×109/L, 加入96孔板中, 将细胞分成4组: 不同浓度的重组BoIL18（005、 010、 020、 025、 030、 040、 050 mg/L）+20 mg/L ConA组、 20 mg/L的ConA组、 细胞对照组与1640空白组, 每组及每个浓度各设8个复孔, 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养48 h, 取细胞培养上清作为被检样品。测定时用Mabtech公司的bIFNγⅠ作为包被抗体、 bIFNγⅡ作为检测抗体, 在酶标仪上读取A450值, P/N≥2.1时判为阳性。
2 结果
2.1 重组转移载体的鉴定 用Nco I与EcoR I对重组质粒repFastBac HTbBoIL18、 转移载体pFastBac HTb分别进行双酶切, 结果显示, 前者得到了4900 bp片段与480 bp的片段, 而后者只有4900 bp片段（图1）; PCR 扩增表明前者得到了480 bp的片段, 而后者没有目的条带, 与预期结果一致（图2）。测序结果表明, 编码BoIL18的成熟蛋白基因完全正确地插入到转移载体的克隆位点。
图1 重组转移载体双酶切鉴定 （略）
1,2: pFastBac HTb/Nco I+EcoR I; 3: DL2000 DNA marker; 4-6: repFastBac HTbBoIL18/Nco I+EcoR I.
图2 重组转移载体的PCR鉴定（略）
1: DL2000 DNA marker; 2: pFastBac HTb的PCR产物; 3: repFastBac HTbBoIL18的PCR产物.
2.2 重组Bacmid的鉴定 由于Bacmid片段较大（>135000 bp）, 不能采用酶切的方法对插入片段进行鉴定, 只能通过PCR扩增进行鉴定。挑取蓝斑做为阴性对照, PCR扩增部位为Bacmid DNA 的MiniattTn 7元件, 扩增片段的长度为273 bp; 以白斑为模板, PCR扩增部位为重组Bacmid 的Tn7R、 Tn7L元件和目的基因, 长度约为2250 bp加上目的基因的长度, 结果得到了长度约2740 bp的片段（图3）, 与预期结果一致。
图3 BacmidBoIL18的PCR鉴定（略）
1: DL15000 marker; 2: Bacmid的PCR产物; 3,4: BacmidBoIL18的PCR产物.
2.3 BoIL18在sf9昆虫细胞中的表达 在不同时间收获重组杆状病毒感染的sf9及培养上清, 细胞超声裂解后离心, 取裂解上清与沉淀进行SDSPAGE电泳, 结果表明, 在不同时间收集的细胞培养上清及其裂解后的沉淀, 电泳后都未见目的条带; 而感染48、 72、 96 h时收集的细胞裂解上清中则有一明显的表达条带, Mr约为26000（图4）。这说明BoIL18在昆虫细胞的裂解上清中得到了表达, 表达的蛋白是可溶性的。Western blot结果显示, 所表达的BoIL18成熟蛋白能与原核表达的BoIL18制备的兔多克隆抗体发生特异性反应, 在预计位置出现了特异性反应条带, 而正常的sf9及Bacmid转染的sf9则没有反应条带。由此可见, 所表达的BoIL18成熟蛋白具有特异性与免疫原性(图5)。
图4 重组BoIL18 SDSPAGE分析（略）
1: 感染重组杆状病毒的sf9的培养上清; 2: 感染重组杆状病毒的sf9的裂解沉淀; 3: 正常sf9的裂解上清; 4-6: 感染重组杆状病毒48、 72、 96 h的sf9的裂解上清; 7: 蛋白质marker.
图5 表达产物的Western blot分析（略）
1: 正常sf9的表达产物; 2: Bacmid转染sf9的表达产物; 3: 重组Bacmid转染sf9的表达产物; 4: 蛋白质marker.
2.4 BoIL18对PBMC的增殖试验 对PBMC的增殖试验表明, BoIL18+ConA组的PI为1165±035, ConA组的PI值为413±029, 二者差异具有统计学意义（P<001）, 这说明表达的BoIL18具有增强淋巴细胞增殖的活性。
2.5 BoIL18促进IFNγ的产生试验 结果显示ConA组的P/N小于21（174±022）, 而不同浓度BoIL18的P/N值分别为221±031、 303±009、 337±017、 355±020、 409±023、 435±022、 482±015, 均大于21, 这说明BoIL18能促进IFNγ的产生, 且随着浓度的增加, BoIL18对IFNγ的诱生作用增强。
3 讨论
IL18是一种多效性的细胞因子, 在抗感染、 抗肿瘤以及免疫调节等方面所发挥的作用, 预示着其具有潜在的临床应用前景,在医学上已经成为研究热点[7]。牛IL18的研究相对比较滞后, 1999年, shoda等[8]完成了该基因的克隆。对牛IL18生物学活性的分析发现, 它是一种具有一定开发应用前景的细胞因子。选择有效的表达系统是进行外源基因高效表达的重要前提。用传统的BEVS(Baculovirus expression vector systems) 表达蛋白, 重组病毒的获得需要多轮的空斑纯化, 而新型BactoBac系统的基因操作完全是在大肠杆菌中进行, 得到的重组子可以直接感染昆虫细胞, 大大提高了工作效率, 是一种快速、 高效、 便捷的新型表达系统[9]。另外, 杆状病毒的宿主范围窄, 仅限于特异的无脊椎生物, 对脊椎动物没有感染力, 因而比其它哺乳动物病毒更加安全。本实验中成功地构建了能够高水平表达BoIL18成熟蛋白的重组杆状病毒, 该病毒表达的BoIL18成熟蛋白在Western blot中, 可被兔抗原核BoIL18蛋白的多克隆抗体识别; 生物学活性试验证明了表达的BoIL18具有增强淋巴细胞增殖、 促进IFNγ产生的活性, 这表明用该系统表达的BoIL18成熟蛋白具有免疫原性和生物学活性, 从而为进一步研究牛IL18蛋白的应用奠定了基础。
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