抗MDV
作者：宋翠萍, 陈鸿军, 秦爱建, 张晨飞
【关键词】 马立克氏病病毒;,VP22,羧基端;,单克隆抗体;,特性鉴定
Preparation and immunological characterization of monoclonal antibodies against VP22 carboxyl terminus of Marek’s disease virus serotype 1
[Abstract] AIM: To prepare and characterize monoclonal antibodies (mAb) against VP22 carboxyl terminus of CVI988/Rispens strain of Marek’s disease virus serotype 1. METHODS: Carboxyl terminus of CVI988 VP22 (94aa~243aa) was expressed in prokaryotic system. mAbs against VP22 were prepared by hybridoma technology from BALB/c mice immunized with the fusion protein GSTVP22C and characterized by ELISA, indirect fluorescence assay (IFA) and Western blot. RESULTS: Two hybridoma cell lines stably secreting mAb against VP22C were obtained and designated as 3F7 and 4E4. mAb 3F7 could react with VP22 expressed in all the plaques, while mAb 4E4 stained all the cells nuclei in MDVinfected CEF cells. It was also found that 3F7 could react with VP22 expressed in Sf9 cells and denatured VP22 by Western blot analysis. In addition, it was further showed that the epitope of mAb 3F7 was located within the domain between 94aa and 193aa, the predicted site of protein transduction domain of VP22. CONCLUSION: The preparation of the mAb is very important to further research in protein transduction domain of MDV1 VP22.
[Keywords]Marek’s disease virus; VP22 carboxyl terminus; monoclonal antibody; characterization
[摘 要] 目的: 制备抗血清I型马立克氏病病毒（MDV1）VP22的单克隆抗体（mAb）, 并鉴定其免疫学特性。方法: 在原核系统中表达VP22 羧基端区域（94~243aa）, 获得融合表达产物GSTVP22C。将该表达产物切胶免疫小鼠, 利用杂交瘤技术制备抗MDV1 VP22C的mAb, 并通过ELISA、 间接免疫荧光（IFA）、 Western blot鉴定其特性。结果: 获得了2株可稳定分泌抗MDV1 VP22C的mAb的杂交瘤细胞, 命名为3F7、 4E4。IFA鉴定表明, 两株mAb均能与感染MDV1的成纤维细胞反应, 其中, 3F7 mAb染色呈现MDV空斑, 而4E4 mAb呈现整个单层的细胞核荧光。ELISA和Western blot分析表明, 3F7能与杆状病毒表达的VP22反应, 4E4不具备该特性。对3F7 mAb进一步鉴定, 确定了该mAb针对的具体位置在94~193aa处, 是蛋白转导域的预测位置。结论: 成功地制备了抗MDV1 VP22C的mAb, 为深入研究VP22蛋白的转导功能提供了有用的试剂。
[关键词]马立克氏病病毒; VP22 羧基端; 单克隆抗体; 特性鉴定
血清Ⅰ型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus serotype 1, MDV1）的VP22由Yanagida等[1]从MDV1 GA株的一段长为8.4 kb的BamHⅠEcoRⅠ片段DNA中得到, 是病毒被膜（在核衣壳和囊膜之间）的主要成分。在组装的病毒子中, VP22脱磷酸化; 但在病毒复制时, 磷酸化的VP22与核基质结合[2]。现已证实VP22是MDV1复制和传播必不可少的组分[3]。Dorange等[4]发现MDV1 VP22具有与HSV1相似功能的蛋白转导域（protein transduction domain, PTD）。随后, Hung等[5]构建了MDV1 VP22与人16型乳头状瘤病毒（HPV16）E7抗原融合表达的DNA疫苗, 结果发现, E7的免疫原性增强, 且主要产生CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答。VP22作为一种便捷的运输工具, 对于弥补DNA免疫缺陷和提高性物质的转导效率具有重要的意义[5]。为深入研究VP22的功能, 制备特异性单克隆抗体（mAb）是非常必要的。在MDV1 VP22方面, Dorange等[3]以杆状病毒的核提取物作为抗原, 筛选到几株针对不同表位的mAb, 通过鉴定发现, 这些mAb针对的表位有很大不同。我们采用杂交瘤技术制备了抗MDV1 VP22羧基端（94～243aa）的特异性mAb, 这对于研究VP22蛋白转导域的功能有非常重要的意义。
1 材料和方法
1.1 材料 CVI988/Rispens、 GA、 RB1B为MDV1, HVT为血清III型MDV, 均由本室保存; 不含插入基因的pGEX6p1质粒转化的非重组菌和宿主菌BL21（DE3）由本室保存; 含重组质粒pGEXVP22C转化的重组菌由本室构建[6, 7], 表达CVI988 VP22的羧基端（94～243aa）; BacToBac系统购自Invitrogen公司。鸡高免MDV多抗血清均由本室制备并保存; 聚乙二醇（PEG4000）、 辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG、 mAb亚类鉴定试剂盒、 FITC标记的羊抗鼠和抗鸡IgG, 均购自Sigma公司; BALB/c小鼠由扬州大学比较医学研究中心提供。
1.2 方法
1.2.1 免疫原的制备及动物免疫 切割SDSPAGE分离的阳性条带, 研磨制备免疫原胶粒, 经腹腔注射6周龄的BALB/c小鼠, 每10 d免疫1次, 7次免疫后72 h时, 按常规方法[8]制备mAb。
1.2.2 mAb亚类鉴定 按照mAb亚类鉴定试剂盒的说明书, 应用捕获ELISA方法, 鉴定mAb的亚型。
1.2.3 间接免疫荧光（IFA）鉴定 用RB1B株、 GA株、 CVI988株、 Fc126株、 J亚群禽白血病病毒（ALVJ）、 禽网状内皮组织增生征病毒（REV）、 小鹅瘟病毒（GPV）、 禽腺病毒（FAVI）、 新城疫病毒（NDV）等感染鸡成纤维细胞（CEF）, 出现病变后, 用冷丙酮: 乙醇（3∶2）固定5 min, PBS洗涤后加杂交瘤细胞上清或腹水, 37℃作用1 h, PBS洗涤后, 加FITC标记的山羊抗鼠IgG, 37℃作用1 h, 通过荧光显微镜观察VP22表达和定位情况, 并以MDV感染鸡的高免血清作对照。
1.2.4 间接ELISA 将含重组质粒pGEXVP22C转化的表达GSTVP22C融合蛋白的重组菌和不含外源基因插入片段的pGEX6P1质粒转化的非重组菌进行IPTG诱导, 采用超声波破碎法在冰浴中破碎细菌, 4℃ 12000 g离心15 min后各取上清, 测定蛋白浓度后作为包被抗原（以免疫小鼠多抗血清经预试验确定最佳包被浓度）, 常规包被封闭和洗涤后, 加入杂交瘤细胞上清, 37℃作用1 h, 同时以高免血清作为阳性、 ICR血清作为阴性对照, PBST洗涤后, 加入1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG, 37℃作用1 h, 常规显色和终止, 测定A490值。
1.2.5 Western blot鉴定 细胞上清对pGEXVP22C菌诱导表达裂解产物和CVI988、 RB1B病毒感染的CEF经120 g/L浓度的胶SDSPAGE电泳分离, 进行Western blot检测。转印后将NC膜置100 mL/L的脱脂乳4℃封闭过夜, 然后置于10 mL封闭液稀释的mAb上清中室温轻轻摇晃作用2 h, 用PBST摇晃洗涤, HRP标记的羊抗鼠IgG工作浓度为1∶5000, DAB避光显色30 min, 水洗终止反应。
1.2.6 mAb相应抗原的定位 利用BacToBac系统构建VP22不同片段的重组杆状病毒rVP22（1～243aa）、 rVP22C（94～243aa）、 rVP22M（94～193aa）、 rVP22H（19～243aa）、 rVP22T（207～243aa）等（另文）, 以M.O.I=1感染Sf9细胞, 72 h后收集细胞并裂解, Western blot检测VP22 mAb针对的表位。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 利用大肠杆菌系统高效表达GSTVP22C融合蛋白（MDV VP22的C端94～243aa）免疫BALB/c小鼠后, 获得2株能稳定分泌抗VP22C mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为3F7和4E4。通过鉴定发现, 两种mAb均能通过IFA与MDV感染的成纤维细胞反应, 其中3F7 mAb可以检测到所有MDV1毒株的空斑内表达的VP22（图1A）, 而4E4 mAb可以检测整个单层的细胞核内VP22的表达（图1B）。mAb亚类鉴定试剂盒鉴定表明, 这2株mAb均属IgM。
图1 4E4和3F7检测CVI988感染的CEF细胞（略）
Fig 1 Detection of CEF cells infected with CVI988 by mAb against VP22 (×20)
A: 3F7; B: 4E4.
2.2 mAb的特异性鉴定 用IFA方法对试验所获得的2株mAb的特异性进行了鉴定。结果证明, 这2株mAb只能与I型MDV所有试验毒株（RB1B、 GA和CVI988）反应, 而与III型的HVT病毒没有反应, 与其他几种不同类型的病毒如NDV、 REV、 GPV、 禽腺病毒、 ALVJ等均无交叉反应性（表1）, 这表明所获得的2株mAb是血清I型MDV特异的抗体。
表1 两株mAb与不同病毒株的IFA反应（略）
Tab 1 IFA results of mAb reacted with different viruses
2.3 mAb的免疫学特性鉴定 为了解这2株mAb的免疫学特性, 首先用不同的免疫学方法对抗体效价进行了测定, 结果见表2。从IFA试验结果可以看出, 3F7能与杆状病毒表达的VP22反应; 而4E4不与杆状病毒表达的VP22反应（图2）。两种杂交瘤腹水IFA效价可达1∶6000, 同时, 3F7和4E4 mAb均具有良好的ELISA反应性（表2）。
Western blot检测结果表明, 3F7 mAb与以上MDV1毒株各抗原均能反应, 在Mr为32000处形成明显的特异性条带, 而4E4不能与之反应, 没有呈现任何特异性条带。利用BacToBac系统构建VP22不同片段的重组杆状病毒, 表达rVP22（1～243aa）、 rVP22C（94～243aa）、 rVP22M（94～193aa）、 rVP22H（19～243aa）、 rVP22T（207～243aa）, 检测结果表明, mAb 3F7针对的抗原表位位于94aa~193aa, 是蛋白转导域的预测位点（图3）。
表2 mAb的免疫学特性（略）
Table 2 Immunological characterization of mAb to VP22C
图2 3F7和4E4对杆状病毒表达产物的IFA检测（略）
Fig 2 IFA detection of VP22 expressed in Sf9 by 3F7 and 4E4 (×20)
A: 3F7 mAb; B: 4E4 mAb.
2.4 感染MDV的CEF细胞中的VP22定位 通过荧光倒置显微镜观察, 发现4E4 mAb主要针对所有细胞核染色, 而且在细胞核膜上亮染; 3F7 mAb染色MDV空斑及其周围被感染细胞中的细胞质; 而高免鸡血清主要染色空斑的胞质（图4）。这一结果再次证明mAb 3F7与4E4针对的表位不同, 也说明VP22具有多种定位特性, 由于VP22是MDV晚期蛋白[1], 所以, 这一结果可以证明VP22能在未形成空斑的CEF中呈现感染早期时的扩散作用。
图3 3F7反应的Western blot分析（略）
Fig 3 Western blot analysis of mAb 3F7
1: Normal CEF; 2: CEF infected with CVI988 virus; 3: Sf9 cells infected with rVP22T baculovirus; 4: Sf9 cells infected with rVP22 baculovirus; 5: Sf9 cells infected with rVP22H baculovirus; 6: Sf9 cells infected with rVP22M baculovirus; 7: Sf9 cells infected with rVP22C baculovirus; M: Protein marker.
图4 mAb检测CVI988感染的CEF细胞（略）
Fig 4 Detection of VP22 on CEF cells infected with CVI988 (×40)
A: 4E4; B: 3F7; C: Chicken sera against mild MDV.
2.5 mAb证明VP22具有蛋白转导作用 由于mAb 4E4和3F7针对的VP22表位不同, 因此, 在检测CVI988 VP22表达时, 采用2株mAb复合染色的方法进行检测（图5）。结果发现: VP22能在空斑上亮染, 并分布在所有细胞核中, 证实VP22具有细胞间转导功能, 从而判断VP22的羧基端可能至少有两种抗原表位。
图5 4E4和3F7 mAb同时检测感染MDV的CEF细胞（略）
Fig 5 Detection of VP22 in CVI988 virus infected CEF cells by mAb 3F7 and 4E4 (×20)
A: Reacted with mAb 3F7; B: The nucleus reacted with mAb 4E4 in nonpathogenic cells; C: Reacted with 3F7 and 4E4 showed VP22 spread into all the nuclei of the monolayer.
3 讨论
利用大肠杆菌表达的VP22C与GST的融合蛋白, 克服了由于VP22C Mr较小（仅14000左右）、 免疫原性较差的缺点。经SDSPAGE电泳后切取凝胶条带进行免疫, 不仅增加了其免疫原性, 而且避免了纯化的天然VP22C抗原的复杂烦琐的制备过程, 最终实验结果也证实了该方法切实可行。筛选mAb时, 考虑到本研究的目的, 主要用直观的IFA法。在制备针对小分子的与异源蛋白联接形成融合蛋白的mAb时, 适当的免疫次数对于提高抗体中小分子所占的比例, 很快获得针对小分子mAb来说至关重要。本研究中, 免疫次数在7次以上时, VP22C抗体呈现高效价。通过常规的杂交瘤技术, 获得了2株mAb 3F7和4E4。特异性试验结果表明, 与所有试验的MDV1反应, 而与HVT以及其他被检测的病毒不反应, 说明mAb具有型特异性。Western blot试验结果表明, mAb 3F7能识别所有试验的不同MDV毒株和重组杆状病毒约32000的蛋白质条带。通过VP22不同大小片段的表达进一步鉴定, 确定了该mAb针对的具体位置位于94~193aa处, 是蛋白转导域的预测位置[9]。然而, 4E4 mAb无Western blot反应性。这一特点类似于抗MDV pp38和pp24的mAb M21[10]。因此, 4E4可能是针对VP22蛋白的立体构象。在IFA检测MDV感染CEF中的VP22时发现, 4E4 mAb主要针对所有细胞核染色, 而且在细胞核膜上亮染; 3F7 mAb可以检测到空斑及其周围被感染细胞胞质中VP22的表达, 对正常未感染细胞核没有染色; 而高免鸡血清主要染色空斑的胞质。这一结果证明3F7与4E4针对的表位不同, 而与Dorange等[3]制备的抗MDV1 VP22 mAb也有明显的区别。在两种抗体复合染色时, 也发现VP22能在所有细胞中呈现亮染, 证实VP22具有细胞间转导功能。这一结果与多抗染色的效果相似, 证实了VP22的羧基端至少有两种抗原表位。结合Dorange等[3]制备的多种表位mAb说明VP22具有多种表位特性。Dorange等[4]通过构建缺失型BAC20证实了VP22是MDV1的空斑形成必需的组分。我们利用mAb 3F7检测MDV感染的CEF发现, VP22能在未形成空斑的被感染CEF中较早地表达, 说明VP22对MDV早期感染、 空斑形成和病毒扩散过程具有重要的作用。然而, 在MDV感染过程中, VP22蛋白转导功能的实现及这一特性对MDV感染过程的意义有待于深入研究。
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