预测的SARS冠状病毒刺突蛋白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中的表达及其抗原性的鉴定
作者：冯宇, 万敏, 王宣军, 张培因, 于永利, 王丽颖
【关键词】 SARS冠状病毒刺突蛋白;,B细胞表位预测;,伴侣10分子;,S2亚基
Expression of predicted B cell epitope peptide in S2 subunit of SARS coronavirus spike protein in E.coli and identification of its mimic antigenicity
[Abstract] AIM: To study the expression of predicted B cell epitope peptide in S2 subunit of SARS coronavirus spike protein in E.coli and its mimic antigenicity to S2 protein. METHODS: B cell epitopes in S2 subunit of SARS coronavirus spike protein was predicted using DNAStar software. The cDNA sequence encoding the B cell epitope peptide was constructed artificially by PCR and then cloned into the downstream of chaperone 10 gene in vector pET28a(+) to construct pET28chap10S2epi plasmid. The fusion protein, chap10S2epi, was expressed in E.coli BL21(DE3) and identified by SDSPAGE and Western blot. The rabbit was immunized by purified Chap10S2epi for the preparation of antiserum, which was used to identify the mimic antigenicity of Chap10S2epi to S2 protein by ELISA. RESULTS: Chap10S2epi fusion protein was successfully constructed and expressed in E.coli. The antiserum from the animal immunized by Chap10S2epi recognized full length of SARS coronavirus S2 spike protein. CONCLUSION: The predicted B cell epitope peptide of SARS coronavirus S2 spike protein can induce the antigenicity of S2 protein, which provides some fundamental data for developing engineering vaccine against SARS coronavirus infection.
[Keywords]SARS spike protein; B cell epitope prediction; chaperone 10; S2 subunit
[摘 要] 目的: 研究预测的SARS冠状病毒刺突蛋白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中的表达及其模拟S2蛋白的抗原性。方法: 用DNAStar软件对S2亚基序列进行分析, 预测B细胞表位所在肽段。通过4轮PCR反应人工搭建预测表位cDNA序列并克隆到含有伴侣10基因的pET28a(+)载体中, 构成重组载体pET28chap10S2epi。重组蛋白Chap10S2epi在E.coli BL21(DE3)中表达并以SDSPAGE和Western blot进行鉴定。用纯化的chap10S2epi免疫家兔制备抗血清, 并通过ELISA判断Chap10S2epi的抗原性。结果: 成功构建并在大肠杆菌中表达了Chap10S2pei融合蛋白。Chap10S2epi免疫的抗血清能识别真核细胞表达的SARS冠状病毒全长S2刺突蛋白。结论: 预测的SARS冠状病毒S2刺突蛋白B细胞表位肽能够诱导家兔产生针对S2蛋白的抗体, 为研制抗SARS病毒基因工程疫苗奠定了基础。
[关键词]SARS冠状病毒刺突蛋白; B细胞表位预测; 伴侣10分子; S2亚基
SARS冠状病毒刺突蛋白（spike protein）是构成病毒衣壳突起的主要结构蛋白, 在病毒侵袭宿主细胞过程中发挥重要生物学功能: 与宿主细胞表面受体结合, 并介导病毒与宿主细胞膜融合使病毒进入宿主细胞[1, 2]。S蛋白由S1、 S2两个亚基构成, 其中S2亚基序列相对保守并参与病毒与宿主细胞膜融合过程, 被认为是产生中和性抗体的重要抗原区[3, 4]。因此, S2蛋白与SARS病毒的高度易感性密切相关。为进一步探讨S2蛋白功能, 本研究中利用分子生物学软件对S2蛋白的B细胞表位进行了多参数预测, 并根据预测结果用人工合成的方法构建了伴侣10S2表位肽融合基因, 在E.coli BL21(DE3)中表达的表位肽融合蛋白与真核表达的全长S2蛋白有部分共同的抗原性, 这为进一步研究S2蛋白功能及研制抗SARS病毒疫苗打下了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 EcoR I、 Nco I及Hind III购于宝泰克生物公司。DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自美国Promega公司。抗组氨酸单克隆抗体（mAb）、 HRP标记的羊抗鼠IgG、 HRP标记的羊抗兔IgG、 卡那霉素、 氨苄青霉素及IPTG均购自Sigma公司。硝酸纤维素膜（NC）购自美国Schleicher&Schuell公司。pET表达系统购自美国Novagen公司。载体pMD18T购于大连宝生物生物工程公司。DNA回收试剂盒购自鼎国公司。E.coli JM109、 BL21由本室保存。用于扩增S2基因的引物由上海生工生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 S2蛋白B细胞表位预测 从GenBank中获取S2蛋白序列, 使用DNAStar软件选取亲水性参数（Hydrophilicity）、 抗原性参数（Antigenicity）、 可及性参数（Accessibility）和二级结构（the secondary structures）进行单参数预测。SARS病毒S2蛋白DNA及氨基酸序列检索自GenBank, 共534个氨基酸, 蛋白序列编号为AAU25830, 基因序列编号为AY707461。使用 DNAStar软件以KytDoolittle标准进行亲水性区域分析, 以Emini方案进行氨基酸位于分子表面可能性分析, 以JamesonWolf方法进行抗原指数分析, 分别以GamierRobson、 ChoFasman及KarplusSchulz方法进行二级结构柔性区域分析。综合各参数预测结果确定S2蛋白的可能B细胞表位区域。
1.2.2 S2蛋白表位肽基因的人工构建 针对预测表位基因序列设计引物, 并将其中的稀有密码子变为大肠杆菌偏爱密码子, 通过4轮PCR反应从目的基因（AY707461: 13366 bp）的中间（149253 bp）向两端延伸, 最后获得目的基因片段。5′端的酶切位点为EcoR I和Nco I, 3′端的酶切位点为Hind III。引物序列如下:
PCR反应条件为 95℃ 30 s, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min, 25个循环周期后, 72℃延伸10 min。
1.2.3 伴侣10S2epi融合基因的构建 将S2表位肽基因（S2epi）与伴侣10基因（Chap10）（由本室构建）相融合, 构建出重组质粒pET28aChap10S2epi。
1.2.4 重组Chap10S2epi蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化 重组质粒经酶切鉴定和测序后转化表达菌BL21(DE3)。挑取单个菌落, 接种于1 L含有卡那霉素（50 mg/L）的LB培养液中。于摇床中以37℃ 225 r/min震荡培养至A600值为10。加入IPTG至终浓度为1 mmol/L进行诱导, 于37℃继续震荡培养3 h后, 离心收集菌体, 用50 mL裂菌液（50 mmol/L Tris、 02 mol/L NaCl、 5 mmol/L 咪唑、 1 mmol/L EDTA、 05 mmol/L PMSF, pH75）重悬菌体, 功率600W超声裂菌3 min, 10000 g离心30 min收集上清。镍金属螯合层析柱（直径16 mm, 柱床体积10 mL）用50 mL裂菌液平衡后, 将超声上清液上样, 用裂菌液洗涤层析柱到流出液A280紫外吸收值小于10, 最后用洗脱液（50 mmol/L Tris、 02 mol/L NaCl、 0.5 mol/L咪唑, pH75）洗脱伴侣10S2融合蛋白。将含有融合蛋白的洗脱液用Sephadex G25层析柱除盐同时将融合蛋白溶解缓冲液更换为PBS。各步骤样品用SDSPAGE进行分析鉴定。
1.2.5 表达产物的Western blot鉴定 为便于用亲和层析法纯化重组蛋白, 使重组基因与载体pET28a上的六聚组氨酸基因融合表达。因此, Western blot中用的一抗为抗六聚组氨酸mAb（IgG）, 第二抗体为HRP标记的山羊抗小鼠IgG。
1.2.6 动物抗血清的制备 采用体质量25 kg雄性健康家兔, 免疫前耳缘静脉采血制备阴性血清, 第1次免疫用皮内多点注射法, 注入完全弗氏佐剂乳化的Chap10S2epi融合蛋白1 mg。2周后第2次免疫, 方法同第1次。第3周静脉注射PBS溶解的Chap10S2epi融合蛋白1 mg加强免疫。第3次免疫后第10天自颈动脉无菌取血, 分离制备血清, 并用ELISA法检测抗体效价。
1.2.7 免疫原性鉴定 采用间接ELISA法, 用SARS病毒S2全长蛋白(由上海新生源提供)包板, 20 g/L BSA进行封闭, 加入阴性血清、 待检测家兔血清, 37℃作用2 h, 洗涤后, 加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG, 最后加入底物液, 于492 nm检测A值。
2 结果
2.1 B细胞表位的预测及cDNA段的构建 用DNAStar对SARS病毒（基因序列编号为AY707461）S2蛋白中可能B细胞表位进行预测, 综合分析各种参数, 选择抗原指数大于0, 亲水性指数大于0, 氨基酸位于蛋白分子表面可能性大于1并且邻近柔性结构的氨基酸区段作为预测的B细胞表位。最后选择位于S2蛋白N端第5-122个氨基酸区段作为包含预测B细胞表位的区段进行克隆构建（图1）。
图1 S2蛋白亲水性区域、 抗原指数、 氨基酸表面可能性及二级结构柔性区域分析（略）
Fig 1 The multiparameter prediction of S2 subunit of SARS coronavirus spike protein
2.2 ChapS2重组质粒的构建与鉴定 根据表位预测结果设计4对PCR引物, 从中间向两端经过4轮PCR反应合成400 bp左右的SARS冠状病毒S2蛋白区可能的B细胞表位编码基因（命名为S2epi）（图2）, 并经DNA序列分析无误。将S2epi基因克隆到pET28分子伴侣10（Chap10）质粒的序列的Chap10基因下游, 构建成pET28Chap10S2epi融合基因重组质粒, 经EcoR I与Hind III酶切电泳后可见一大小为400 bp左右的片段（图3）。
图2 PCR法搭建S2epi基因片段的电泳图（略）
Fig 2 Construction of S2epi gene by PCR
M: DNA marker; 1: PCR product.
图3 pETchap10S2epi重组质粒酶切鉴定（略）
Fig 3 Construction of pET28achap10S2epi recombinant vector
M: DNA marker; 1: pET28achap10S2epi recombinant vector digested by EcoR I and Hind III; 2: pET28a plasmid digested by EcoR I and Hind III.
2.3 重组Chap10S2epi蛋白的表达与纯化 将转化pET28Chap10S2epi重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导3 h后超声裂解, 经SDSPAGE鉴定, 重组蛋白为可溶性表达（图4 中1和2泳道）。裂菌所得上清经镍亲和层析及G25除盐纯化后获得表观相对分子质量(Mr)约为30000的蛋白（图4）, 与理论推测的重组蛋白Mr相符。
图4 chap10S2epi蛋白的表达纯化（略）
Fig 4 Expression and purification of chap10S2epi fusion protein
1: BL21(DE3) induced for 3h; 2: BL21(DE3) uninduced Lane; 3: Chap10S2epi desalted by Sephadex G25; 4: Chap10S2epi preparation prior to desalting; 5: Breakthrough fraction from Ni Sepharose FF column; 6: Fractions eluted from Ni Sepharose FF column; M: Low molecular weight marker.
2.4 重组Chap10S2epi蛋白的Western blot鉴定 用抗His tag的mAb对SDSPAGE电泳分析的重组Chap10S2epi蛋白进行Western blot鉴定, 结果显示: pET28Chap10S2epi重组质粒转化的表达菌出现了阳性条带, 而pET28空质粒转化菌无反应条带（图5）。
图5 Chap10S2epi基因融合表达产物的Western blot鉴定（略）
Fig 5 Identification of chap10S2epi by Western blot
1: BL21(DE3) harboring pET28a plasmid; 2: BL21(DE3) harboring pET28Chap10S2epi plasmid.
2.5 Chap10S2epi重组蛋白的免疫原性鉴定 用全长S2蛋白作为检测抗原, 采用ELISA法检测Chap10S2epi蛋白免疫的家兔血清中抗SARS冠状病毒S2蛋白抗体的水平, 结果显示: 家兔血清1∶100、 1∶200、 1∶400稀释组A492值大于阴性对照组A492值2倍（图6）, 说明家兔血清中含有能识别SARS病毒S2蛋白的抗体。
图6 Chap10S2epi的蛋白免疫原性鉴定（略）
Fig 6 Identification the immunogenicity of Chap10S2epi
3 讨论
病毒中和性B细胞抗原表位的确定对SARS的诊断、 疫苗分子设计及免疫干预至关重要。SARS是由冠状病毒引起的一种急性传染病, 在SARS治疗过程中, 使用康复病人血清取得了一定的疗效, 肯定了中和性抗体在SARS治疗及预防中的作用, 但使用康复病人血清效果并不稳定, 并且存在潜在的安全性问题。本研究根据B细胞表位特征, 先预测抗原表位, 通过人工合成的方法构建出SARS冠状病毒刺突蛋白S2亚基cDNA, 在大肠杆菌中表达后使用金属鏊合层析纯化获得伴侣10S2表位融合蛋白（Chap10S2epi）, 避免了从SARS患者组织或体液提取DNA的不安全性, 是一种、 省时、 省力的方法。应用各种相关软件对蛋白质的结构和特征进行预测, 特别是表位预测, 在医学、 生物领域里都得到了证实[5]。在对SARS病毒S2蛋白氨基酸序列分析的过程中, 我们发现病毒S2蛋白N端5122个氨基酸序列片段显示多种方法预测的一致性, 该区域具有较好的亲水性和可及性, 在二级结构上则含有不规则卷曲和β转角结构, 这些特点与蛋白质抗原决定簇的结构特点相符[6]。在随后的ELISA实验中, 由融合蛋白制备的抗血清与酵母表达的S2完整蛋白相结合, 证实了我们所预测的B细胞表位的准确性。更进一步的实验可以使用SARS活病毒进行病毒中和实验, 确定此区域中是否含有中和性的B细胞表位。分子伴侣10（Chap10）为一Mr10000的蛋白, 属于热休克蛋白家族中的成员, 是HSP60的共伴侣分子, 一同参与蛋白的折叠。分子伴侣被定义为能结合和稳定另一蛋白质不稳定构象异构体的一组蛋白质, 并通过结合和释放,在体内可利于其他蛋白质的正确组装、 折叠、 跨膜转运及错误折叠蛋白质的降解[7]。真核细胞蛋白在原核细胞中表达时往往形成不可溶的包涵体。以包涵体形式存在的蛋白由于没有有正确的三级结构, 所以不具有相应的生物学活性。从包涵体中提取活性蛋白要经过繁琐的包涵体制备、 溶解、 纯化、 重折叠等过程, 这不但增加了蛋白质纯化过程的难度而且往往活性蛋白得率很低[8]。在本研究中, S2表位蛋白与分子伴侣10形成的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶的形式表达, 利用融合蛋白C端所带有的六聚组氨酸纯化标签可以一步亲和层析纯化获得较高纯度的S2蛋白进行后续的蛋白质功能研究, 避免了复杂的包涵体纯化过程。并且由于Chap10S2epi蛋白N端的分子伴侣10的存在, 提高了蛋白的表达水平, 使得融合蛋白表达水平占菌体总蛋白的40%左右。综上所述, 我们通过对SARS病毒S2蛋白氨基酸序列的分析, 预测了S2蛋白中B细胞表位所在肽段, 然后采用人工合成基因的方式用PCR法构建出该肽段的cDNA片段, 再将该肽段与伴侣10分子在大肠杆菌中进行融合表达, 并用纯化后的融合蛋白免疫动物制备多克隆抗体, 最后应用ELISA法确定产生的抗体可与酵母表达的完整S2蛋白结合, 证实了所预测B表位的正确性。本研究结果为进一步研究SARS病毒S2蛋白的功能及研制抗SARS病毒基因工程疫苗打下了基础。
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