细胞外信号调节激酶1/2的阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞增殖的影响
作者：滕振平, 邢飞跃, 王通, 李莉平
【关键词】 细胞外信号调节激酶1/2;,淋巴细胞;,增殖;,细胞周期
Effect of extracellularsignal regulated kinase 1/2 specific repressor PD98059 on murine lymphocyte proliferation
[Abstract] AIM: To investigate the effect of PD98059, a specific repressor of extracellular signal regulated kinase1/2 (ERK1/2), on the proliferation of the murine lymphocytes. METHODS: Lymphocytes were isolated from lymphoid nodes of BALB/c mouse. After stained with carboxy fluorescein diacetate, succinimidyl ester(CFDASE), the cells were stimulated with polyclonal activators, concanavalin(ConA) and phorbol 12,13dibutyrate(PDB) plus ionomycin(Ion). The proliferation and cellcycle of lymphocytes were analyzed using flow cytometry（FCM）. RESULTS: CFDASE staining showed that 5, 10, 20, 30 and 40 μmol/L PD98059 could significantly inhibit the proliferation of murine lymphocytes induced by ConA. The inhibitory effect was dosedependent(r=0.985, P<0.01). The optimal concentration of 30 μmol/L PD98059 was selected and its inhibitory effect was significantly decreased with prolongation of time (P<0.01); but the inhibitory rate increased. Analysis of the cell cycle induced by ConA revealed that the cells was blocked into S and G2/M phases as the concentration of PD98059 increased. However, the cell number in subG0/G1 peak (apoptotic peak) had no significant change under the concentration range used. PD98059 had the similar effect on the cells treated with PDB plus Ion, but S and G2/M phases were more distinct. CONCLUSION: PD98059 can inhibit the proliferation of the murine lymphocytes and blocked them into S and G2/M phases, indicating the activation of ERK1/2 signaling pathway plays an important role in the proliferation of lymphocytes.
[Keywords]extracellularsignal regulated kinase1/2; lymphocytes;proliferation; cell cycle
[摘 要] 目的: 探讨细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号通路的特异性阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响。方法: 分离小鼠淋巴结细胞, 藉羧基荧光素乙酰乙酸（CFDASE）染色, 用多克隆刺激剂刀豆A蛋白(ConA)或者佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激, 以流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞增殖的影响; 利用碘化丙锭(PI)染色分析PD98059对细胞周期的影响。结果: CFDASE染色分析显示, 当浓度为5、 10、 20、 30、 40 μmol/L时, PD98059对ConA诱导的淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用, 并呈现明显的剂量依赖关系（r=0.985, P<0.01）。选择最佳浓度30 μmol/L的PD98059, 观察其对不同时间淋巴细胞增殖的影响, 结果发现, 随着时间的延长, PD98059对淋巴细胞增殖的抑制作用明显降低(P<0.01), 但抑制率随时间的延长而明显升高。细胞周期分析进一步表明, PD98059可阻止ConA刺激的淋巴细胞进入S期和G2/M期, 而亚二倍体峰变化并不明显。PD98059对PDB+Ion刺激的淋巴细胞细胞周期的影响与ConA刺激相似, 不同的是S期和G2/M期的变化较ConA的作用更明显。结论: PD98059对小鼠淋巴细胞的增殖有明显地抑制作用, 并可阻止其进入S期和G2/M期, 提示ERK1/2信号通路的活化在淋巴细胞增殖中起重要作用。
[关键词]细胞外信号调节激酶1/2; 淋巴细胞; 增殖; 细胞周期
细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2)是ERK家族的重要成员, 它们表达广泛, 涉及调节细胞的许多生物学行为。多种刺激因子如生长因子、 细胞因子、 病毒等均可激活这条信号通路, 从而诱导多种细胞增殖、 分化、 细胞周期的变化和凋亡等[1-4]。PD98059是ERK1/2信号通路中的一种细胞渗透性和选择性的特异性阻断剂。自1995年以来, 已有不少学者利用其阻断ERK1/2信号通路的活化, 来探索该信号通路在调控细胞的生物学行为及其功能中的作用[5]。国外研究表明, ERK1/2信号通路的活化对淋巴细胞的增殖有显著影响。Richards等[6]发现, 抑制ERK1/2信号通路可显著改变淋巴细胞诱导蛋白的表达, 如抑制转录因子Egr1、 细胞黏附分子CD44及B细胞标记物CD69的表达, 均可影响B细胞的增殖。此外, Piatelli等[7]发现, 用PD98059抑制ERK1/2信号通路可导致hsp90诱导的淋巴细胞增殖作用降低; 但相反的结果也见报道[8]。另有学者发现, ERK1/2信号通路对胸腺淋巴细胞具有双重调节作用[9]。可见, 有关ERK1/2信号通路在淋巴细胞增殖中的作用仍存有争议, 因此, 值得进一步证实。
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物SPF级、 BALB/c小鼠, 雄性, 6～8周龄, 体质量(20±2) g, 购自南方医科大学实验动物中心。PD98059购自CALBIOCHEM公司。 二丁基佛波醇酯(phorbol 12,13dibutyrate, PDB)、 离子霉素(ionomycin, Ion)、碘化丙锭(propidium iodide, PI)、 L谷氨酰胺、 β巯基乙醇及刀豆蛋白A(concanavalin, ConA), 均购自Sigma公司。RPMI1640培养基、 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为GibcoBRL公司产品。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(carboxy fluoresce in diacetate succinimidyl ester, CFDASE)购自Molecular Probes公司。流式细胞仪(FACSCalibur)为Becton Dickinson公司产品。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞悬液的制备 将BALB/c小鼠断髓处死, 用700 mL/L酒精浸泡30 s, 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅淋巴结和肠系膜淋巴结。去掉被膜, 用无菌细胞研磨棒极轻柔地研磨细胞(研磨力度过大受械损伤诱导的凋亡细胞数明显增多, 将极大地影响试验结果), 收集细胞, 用冷PBS离心(180g, 5 min)洗涤细胞2次, 再用PBS重悬。
1.2.2 淋巴细胞CFDASE染色 CFDASE用DMSO溶解成10 mmol/L的储存液, 于-20℃保存。临用前, 取适量用PBS稀释成2 μmol/L的工作液, 平衡至室温备用。计数并调整淋巴细胞悬液的密度为2×1010/L, 加入等体积的CFDASE工作液(终浓度为1 μmol/L), 充分混匀后在室温条件下轻轻振荡10 min。然后用冷PBS离心(180g, 5 min)洗涤细胞2次, 悬浮于含100 mL/L FBS的RPMI1640完全培养基中, 并调整细胞的密度为2×109/L。
1.2.3 PD98059对淋巴细胞增殖的影响 (1)浓度的影响: 将上述经CFDASE标记的淋巴细胞按每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中, 实验分为空白对照组（正常培养的淋巴细胞）、 DMSO组（因PD98059是用DMSO为溶剂配制, 加入2 μL DMSO, 以检测DMSO对正常细胞是否有毒性）、 ConA组、 不同浓度的PD98059组（加入5、 10、 20、 30、 40 μmol/L PD98059各2 μL）, 共8组, 每组均设3个复孔取其平均值。在37℃、 50 mL/L CO2恒温饱和湿度细胞培养箱内温育1.5 h后, 在不同浓度的PD98059组中, 分别加入1 g/L的ConA 2 μL（终浓度为1 mg/L）进行刺激, 在相同条件下培养72 h后进行检测。(2)作用时间的影响: 将上述经CFDASE标记的淋巴细胞按每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中, 从PD98059对淋巴细胞增殖影响的实验中, 选取最佳浓度30 μmol/L PD98059进行实验。实验分为空白对照组、 ConA组、 30 μmol/L PD98059组, 共3组, 每个时间点均设3个复孔取其平均值, 培养条件及加入ConA的浓度同上述, 于不同的培养时间点（24、 48、 60、 72、 96 h）进行检测。
1.2.4 PD98059对淋巴细胞细胞周期的影响 按上述方法分离小鼠淋巴细胞, 悬浮于含100 mL/L FBS的RPMI1640完全培养基中, 并调整细胞的密度为2×109/L。按每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中, 实验分为空白对照组、 ConA组、 不同浓度的PD98059组同上述, 共7组, 每组均设3个复孔取其平均值。在37℃、 50 mL/L CO2恒温饱和湿度细胞培养箱内温育1.5 h后, PD98059组分别加入ConA(终浓度1 mg/L)进行刺激, 在上述条件下培养48 h。同样, 选取PDB(终浓度0.2 μmol/L)+Ion(终浓度为0.5 mg/L)作为刺激剂, 重复上述实验过程。48 h后, 分别收集由两种不同的刺激剂作用的细胞, 用PBS离心(180g, 5 min)洗涤细胞1次。并取300 μL含100 mL/L普通级小牛血清的PBS重悬细胞, 震荡加入700 μL无水乙醇, 固定30 min, 用冷PBS离心(180g, 5 min)洗涤2次, 加入400 μL PI染液(含有50 mg/L PI、 1 mL/L TritonX100、 0.1 mmol/L EDTA和50 μL/mL RNase), 避光放置15 min, 以流式细胞术检测DNA的含量。
1.2.5 流式细胞术检测 全部数据经FACSCalibur流式细胞仪检测,每管样品检测10000个细胞, 获得的数据用CELLQuest软件分析。CFDASE的各代增殖比例和增殖指数(proliferation index, PI)利用Modfit LT3.0分析。不同时间点的30 μmol/L PD98059组对淋巴细胞增殖的抑制率（%）, 按下列公式。抑制率={[ConA组的PI值－（ConA+PD98059）组的PI值]/ConA组的PI值}×100%。
1.2.6 统计学分析 用统计软件包SPSS10.0进行处理, 数据以x±s表示, 多组间比较采用OneWay ANOVA, 两组间比较用非配对Student’st检验。
2 结果
2.1 不同浓度的PD98059对淋巴细胞增殖的影响 用ConA刺激72 h后, 淋巴细胞最多可分裂5次, 而ConA+40 μmol/L PD98059组几乎完全抑制淋巴细胞增殖。在5、 10、 20、 30、 40 μmol/L PD98059的作用下, 淋巴细胞的分裂代数依次减为5、 4、 3、 2、 1代, 其增殖率也呈相应的变化, 说明PD98059可明显抑制ConA刺激引起的淋巴细胞增殖, 且呈剂量依赖性。在培养72 h后, 空白对照组的CFDASE流式细胞术检测结果仅显示单一亲代峰, 增殖指数（PI）为100, 表明细胞未增殖。DMSO组的PI也为100, 表明DMSO对细胞的生长无影响, 与对照组相比无统计学差异。仅在ConA刺激下小鼠淋巴细胞增殖明显, 出现的子代峰为5代, PI为268; 而加入不同浓度的PD98059(5、 10、 20、 30、 40 μmol/L)后, ConA介导的小鼠淋巴细胞的增殖明显下降, 亲代峰细胞数增多, 子代的细胞数减少（少于ConA组）, 且呈剂量依赖性（r=0.985, P<0.01, 图1A）。PI依次下降为191、 170、 139、 116、 103（图1B）。
图1 不同浓度的PD98059对ConA刺激淋巴细胞增殖的影响（略）
Fig 1 Effect of different concentrations of PD98059 on the proliferation of lymphocytes stimulated with ConA（n=3）
PD: PD98059; Stimulating time: 72 h; bP<0.01 vs ConA group; dP<0.01 vs control group.
2.2 PD98059作用不同时间对淋巴细胞增殖的影响 流式细胞术分析显示, 随着时间的延长, ConA+30 μmol/L PD98059组对淋巴细胞增殖的抑制作用明显减弱, 48 h时ConA组与ConA+30 μmol/L PD98059组已显示差别, 随着时间的延长差别更加明显。ConA组（培养24、 48、 60、 72、 96 h）的PI依次变为1.00、 1.23、 2.31、 2.68、 5.67; 而ConA+30 μmol/L PD98059组（培养24、 48、 60、 72、 96 h）的PI依次变为1.00、 1.03、 1.11、 1.16、 1.30（图2A）, 但抑制率随着时间的推移明显上升, 依次为0%、 16.3%、 51.8%、 56.9%、 76.7%（图2B）。
图2 30 μmol/L的PD98059作用后不同时间对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响（略）
Fig 2 Effect of different time（h） exposed to 30 μmol/L PD98059 on the proliferation of lymphocytes（n=3）
PD: PD98059; Dosage of PD98059: 30 μmol/L; bP<0.01 vs 24 h group.
2.3 PD98059对淋巴细胞细胞周期分布的影响 PI可特异性地结合DNA并发出红色荧光, 由于凋亡小体的形成, 晚期凋亡的细胞往往伴随着DNA的丢失。在PI染色条件下, 细胞的荧光强度低于G0/G1期的细胞, 而在流式细胞术检测的直方图上则显示出亚二倍体峰。在ConA诱导的淋巴细胞的细胞周期模型中, 浓度为5、 10、 20、 30、 40 μmol/L的PD98059能明显阻止淋巴细胞进入S期和G2/M期, 并使G1/G0期细胞的百分率上调, 而亚二倍体峰变化并不明显。同样, 在PDB+Ion诱导的淋巴细胞的细胞周期模型中, 不同浓度的PD98059蛋白也能阻止淋巴细胞进入S期和G2/M期, 不同的是S期和G2/M期的变化较ConA作用更明显(表1、 2)。
表1 不同浓度的PD98059对ConA刺激的淋巴细胞细胞周期的影响（略）
Tab 1 Effect of different concentration of PD98059 on the cell cycle of lymphocytes stimulated by ConA
aP<0.05, bP<0.01 vs ConA group; AP peak: Apoptotic peak; PD: PD98059; Stimulating time: 48 h.
表2 不同浓度的PD98059对PDB+Ion刺激的淋巴细胞细胞周期的影响（略）
Tab 2 Effect of different concentration of PD98059 on cell cycle of lymphocytes stimulated by PDB+Ion
bP<0.01 vs P+I group; AP peak: Apoptotic peak; PD: PD98059; P+I: PDB+Ion; Stimulating time: 48 h.
3 讨论
有关ERK1/2信号通路在淋巴细胞增殖及其细胞周期调控中作用的研究刚刚起步, 其确切的机制还有待于深入研究。通常研究细胞增殖多是利用[3H]胸腺嘧啶核苷掺入法或MTT比色法[6, 9], 但这些方法只能分析群体细胞整体增殖的情况, 无法详细分析细胞增殖的代数和比例。我们应用近年起来的新技术, 采用活体染料CFDASE标记追踪淋巴细胞增殖, 利用CFDASE荧光强度的系列减半及其对细胞低毒的特征, 采用流式细胞术对细胞增殖的代数和比例进行详细的分析, 分别从两个不同的角度检测了PD98059对淋巴细胞增殖的影响。即检测不同浓度的PD98059在培养72 h时对淋巴细胞增殖的影响, 以及不同时间点ConA+30 μmol/L PD98059组对淋巴细胞增殖的影响。结果表明, PD98059对淋巴细胞增殖有明显的抑制作用, 且呈剂量依赖性。此外, 利用两种不同的刺激剂(ConA和PDB+Ion)对细胞周期进行了检测, 证明两者的结果相似, PD98059可使活化T细胞的增殖大部分停滞于G0/G1期。这种作用很可能直接影响活化相关途径和抑制细胞增殖的相关蛋白。以上结果进一步证实, 阻断ERK1/2信号通路能明显抑制淋巴细胞的增殖。总之, 利用ERK1/2信号通路的特异性阻断剂PD98059蛋白, 阻断ERK1/2信号通路, 确实能明显抑制淋巴细胞增殖, 这与大多数的研究相符合。有学者认为, 固有免疫中的模式识别受体及其信号转导是当代免疫学中最伟大的发现之一[10], 因此, 探明ERK1/2信号通路在淋巴细胞增殖中的作用及其信号调控机制, 可望为肿瘤和免疫相关性疾病的寻找到新的靶点。
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