中药免疫调节剂对小鼠细胞免疫功能的影响

               作者：刘翠艳, 赵宏坤，韩春杨

【关键词】  中药免疫调节剂;,小鼠;,脾淋巴细胞转化;,含药血清

　　[摘 要]  目的: 探讨中药免疫调节剂对正常小鼠及环磷酰胺(Cy)所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。方法: 以Cy诱导建立免疫抑制小鼠模型, 给正常小鼠和免疫抑制小鼠饮服中药及生理盐水, 采用MTT法检测淋巴细胞的增殖反应情况。结果: 试验各组小鼠脾细胞在48 h培养时间内淋巴细胞转化率与各组含药血清加入到正常小鼠脾细胞反应体系中, 在相同培养时间内的淋巴细胞转化率呈高度正相关。表现为: 在机体正常条件下, 两个中药组与正常组之间差异无统计学意义（P>0.05）, 但均高于Cy组（P<0.05）; 在免疫抑制条件下, 两个中药组明显高于正常对照组和Cy组（P<0.05）, 且中药免疫调节剂组优于玉屏风组（P<0.05）; 另外, 50 mL/L浓度的含药血清优于100 mL/L浓度的含药血清（P<0.05）。结论: 该中药免疫调节剂能显著促进免疫抑制小鼠淋巴细胞的转化, 而对正常小鼠作用不明显。

　　[关键词]中药免疫调节剂; 小鼠; 脾淋巴细胞转化; 含药血清

　　目前, 国内外在中药免疫调节剂的研究开发方面, 研究单味药和其所含的单体成分（最多的是多糖, 其次为有机酸、 甙类、 生物碱、 黄酮等）占多数[1-3], 复方研究较少且不深入。但是, 正是复方制剂的复杂成分才获得了单味药和单体成分所不具备的药效整体性和协同互补作用, 使疗效增强、 毒副作用减少, 在实际应用中更具优势。为此, 我们根据中药方剂的组成原则, 结合药研究成果, 以具有免疫调节作用的经典方剂“玉屏风散”为对照, 通过体外筛选、 毒性测定, 最后由黄芪、 茯苓、 白术、 甘草、 防风、 桔梗6味药组成了复方中药免疫调节剂, 并用MTT法探讨了该中药免疫调节剂对正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  RPMI1640培养基（Gibco公司）; MTT（四甲基偶氮唑盐, Amresco公司）, 以pH7.2的 RPMI1640培养液制成5 g/L溶液; PHA（Sigma公司）, 以pH7.2的RPMI1640培养液制成200 mg/L溶液; 小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司, 批号: 051215); 环磷酰胺（Cy, 上海华联制药有限公司, 批号: 050306）; 中药免疫调节剂（ZY）: 黄芪、 茯苓、 白术、 防风、 甘草、 桔梗组成复方免疫调节剂, 采用自动循环煎药机提取浓缩, 按照生药量使终浓度为300 g/L, 购自山东泰安工商联医药商行。玉屏风散（YPF）: 选自《兽药典》; MC0175型CO2恒温培养箱（日本SANYO）; COIC3168型倒置相差显微镜（重庆光学仪器厂）; 2010型BLOCELLHT系列酶标仪（郑州博塞生物工程有限责任公司）; SWCJIF型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）; 96孔细胞培养板（Becton Dickinson, USA）; 6周龄昆明种小鼠72只, 质量18～20 g, 雌雄各半, 购自山东米歇尔生物制品有限公司动物饲养中心, 实验动物生产许可证号: 20030011。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组及处理方法  将72只小鼠随机分为6组: 第1组为正常对照组,  定量给水给料; 第2组为Cy对照组, 于试验的第4天注射Cy, 按50 mg/kg, 连续7 d; 第3、 4组为中药免疫调节剂组（简称中药组）, 小鼠给药方式采取饮水给药, 1次/d, 按体表面积折算动物的等效剂量的2倍给药, 12 mL/(d・鼠), 连续15 d; 第5、 6组为玉屏风散组, 12 mL/(d・鼠)。其中第3、 5组只给药不注射Cy, 第4、 6组给药并于第4天饮完药1 h后注射Cy（剂量、 疗程同第2组）。

　　1.2.2  含药血清的制备  采用摘眼球法在最后一次给药1 h后（采血前先禁食12 h）采血。血液置于1 mL离心管内, 静置2 h, 3000 r/min离心20 min, 无菌分离血清, 56℃水浴30 min灭活后, 置4℃冰箱保存, 24 h内使用。

　　1.2.3  小鼠脾淋巴细胞的制备  各组小鼠无菌取脾脏, 在冷Hank’s液中将脾组织制备成单个脾细胞悬液, 1500 r/min离心10 min, 弃上清液, 加入6 mL 8.3 mL/L TrisNH4Cl,  37℃水浴5 min使红细胞裂解后1500 r/min离心10 min, 弃上清液, 加入适量Hank’s缓冲液吹洗3次, 每次1500 r/min离心10 min, 弃上清液, 用不含血清的RPMI1640培养液调整细胞密度至5×109/L, 并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。

　　1.2.4  脾淋巴细胞增殖反应的测定

　　1.2.4.1  含药血清对正常小鼠脾淋巴细胞转化的影响  当血清浓度为50 mL/L时, 在96孔细胞培养板上, 每孔加入50 μL 5×109/L小鼠脾淋巴细胞, 45 μL不含血清的RPMI1640及5 μL含药血清; 当血清浓度为100 mL/L时, 在96孔细胞培养板上, 加入50 μL5×109/L小鼠脾淋巴细胞, 40 μL不含血清的RPMI1640液及10 μL含药血清。每组血清设4个重复孔, 并与同等浓度的小牛血清RPIM1640液作比较, 同时设培养液空白对照。

　　1.2.4.2  各试验组小鼠脾细胞的淋巴细胞转化试验  在96孔细胞培养板上, 每孔加入用含100 mL/L小牛血清RPMI1640稀释的5×109/L小鼠脾淋巴细胞95 μL, A、 B、 C、 D4横排各孔均加入不含血清的RPMI1640液5 μL, E、 F、 G、 H4横排各孔均加入200 mg/L的PHA 5 μL, 每组细胞设4个重复孔, 并用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640作空白对照。上述细胞均置37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养44 h, 各孔加5 g/L的MTT 10 μL, 继续培养4 h后, 加入SDSDMF溶解液50 μL, 30 min后用酶标仪测A570, 结果用刺激指数（SI）表示: SI＝试验孔A均值/对照孔A均值×100%。

　　1.2.5  数据处理  应用统计软件SPSS10.0进行分析, 所有数据用均值±标准差（x±s）表示。

　　2  结果

　　2.1  各组小鼠脾淋巴细胞转化结果  Cy对照组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值明显低于正常对照组, 有统计学差异（P<005）; 中药免疫调节剂组和玉屏风散组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值与正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）; 而Cy+中药免疫调节剂组和Cy+玉屏风散组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值明显高于正常对照组（P<0.05）, 且Cy+中药免疫调节剂组对于淋巴细胞转化的促进作用优于Cy+玉屏风散组（P<0.05）。另外, 在PHA的刺激下, 各组淋巴细胞转化的A570值都有了显著提高, 且以Cy+中药免疫调节剂组及Cy+玉屏风散组最为明显（P<0.05, 表1）。

　　表1  各组小鼠脾淋巴细胞转化结果（略）

　　注: 同一列数值标有相同字母者之间无统计学意义; 标有不同字母者之间有统计学差异(P<0.05),    下表同.

　　表2  含药血清对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）

　　2.2  含药血清对小鼠脾淋巴细胞转化的影响  在健康小鼠脾淋巴细胞的转化试验中, 无论加入浓度为50 mL/L还是100 mL/L的各试验组血清, Cy+中药组及Cy+玉屏风散组A570值明显高于其他组（P<0.05）; Cy对照组A570值明显低于正常对照组（P<0.05）; 单纯的中药组和玉屏风散组A570值与正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）, 但均高于Cy组血清（P<0.05）。说明含药血清对免疫功能异常小鼠具有明显的免疫调节功能, 且在50 mL/L血清浓度时Cy+中药组血清的促进淋巴细胞转化作用优于Cy+玉屏风散组（P<0.05）。50 mL/L血清浓度与100 mL/L血清浓度相比, 有统计学差异（P<0.05, 表2）。

　　3  讨论

　　目前, 检测淋巴细胞转化最常用的方法是同位素掺入法和MTT法, 实验证明两种方法具有显著的相关性[4]。本试验中选用MTT法研究中药免疫调节剂对小鼠细胞免疫功能影响。多次重复试验结果表明, 在对试验各影响因素进行充分优化的基础上, MTT法的确简便实用, 重复性好。“玉屏风散”为扶正固表的经典方剂, 近年来大量的体内外研究表明其对免疫系统存在着较为广泛的影响[5]。玉屏风散含药血清具有明显活化小鼠白细胞和腹腔巨噬细胞作用, 对脾淋巴细胞增殖、 IL2产生有促进作用, 对NK细胞的活性有明显的增强作用[6]; 因此我们的试验选用“玉屏风散”为对照方剂。本试验中采用了各组小鼠脾细胞直接做淋巴细胞转化试验以及把各组含药血清加到淋巴细胞转化反应体系中两种不同的研究方法, 其结果一致表明: 玉屏风散和中药免疫调节剂对正常小鼠脾淋巴细胞转化均未出现明显的促进作用, 而对免疫抑制小鼠却效果明显, 且以中药免疫调节剂作用更好。血清药理试验还表明, 50 mL/L、 100 mL/L两种含药血清浓度对脾淋巴细胞的增值均有促进作用, 经统计学分析, 50 mL/L的血清浓度效果优于100 mL/L的血清浓度。由此我们可以认为, 在机体处于免疫抑制的状态下, 中药对免疫系统能更好的发挥其正向调节作用, 促进淋巴细胞增殖, 增强机体免疫力。 有试验表明, 鳖血提取物、 玉屏风散和四君子汤对免疫功能低下的小鼠的促进作用明显高于正常小鼠[7, 8]。分析其原因, 我们认为可能是由于免疫抑制剂环磷酰胺毒副作用较小, 在环磷酰胺作用下淋巴细胞未分裂也未凋亡, 当应用中药免疫调节剂解除其抑制作用后, 中药成分影响了免疫抑制小鼠的神经、 内分泌功能, 从而改变了神经－内分泌－免疫调节平衡, 使得免疫抑制小鼠对药物的反应性高于正常对照组, 造成短时间内免疫细胞超常分裂的结果。中药血清药研究方法针对中药及其复方成分的复杂性, 以及中药汤剂及粗提物的体外试验受到其电解质、 渗透压等多种因素的影响, 以动物含药血清代替中药煎剂或粗提物进行体外试验, 比较接近于动物体内环境, 增加了中药体外试验的真实性、 可信性和性。但目前该方法还有许多影响因素尚未规范, 因此对于任何一个试验都有必要尽可能细致地探讨其每一个影响因素,特别是象给药量、 采血时间点、 血清添加浓度等因素。试验中我们的采血时间设在给药后1 h, 是根据时效关系的预试验确定的。在预试验中, 对Cy所致免疫抑制小鼠给药后15、 30、 60、 90、 120、 180、 240 min共7个时间点分别采血分离血清, 用于淋巴细胞转化率的测定, 结果给药后30～120 min采集的血清与对照组比, 均能显著促进小鼠淋巴细胞的转化, 以给药后60 min采集的血清效果最好, 故正式试验时我们的采血时间设在给药后1 h。其他几种处理方式的选择依据: ①小鼠的给药方式不采用传统的灌胃法, 而是采用在干渴状态下饮水的方式,  不但能减少应激, 不会对消化道造成损伤, 而且能大大减少人力和给药操作时间。预先摸索小鼠的全天饮水量, 然后在干渴的状态下给药, 小鼠饮完药液一段时间后再适量补充清水。试验表明, 这种给药方式是可行的, 尤其适合于异味不太大的补养药。②Cy的注射剂量按50 mg/kg是根据周华等[9]的试验结果,   用50 mg/kg的剂量不但可以成功造模, 还可以充分体现出作用温和的中药复方对免疫抑制动物体液免疫的促进活性。本试验证明, 该剂量可以充分体现中药复方对免疫抑制动物的体液免疫功能（另文报道）和细胞免疫活性的影响。③为使细胞生存条件尽可能完全一致, 培养过程中也不发生改变, 应用不含血清的RPMI1640液溶解MTT和PHA, 可促进细胞对MTT和PHA的吸收, 增加结晶的产生和减少孵育时间。

　　:

　　[1] 谢陶吟, 赵  虎, 高向东. 多糖单克隆抗体的研究进展[J]. 药学进展, 2005, 29（9）: 391-397.

　　[2] 张  群, 雷林生, 吴曙光. 多糖类药物作用的受体及信号转导机制的研究进展[J]. 中草药, 2005, 36(4): 614-616.

　　[3] 张其威, 张楚瑜. 抗病毒中药研究的最新进展[J]. 中成药, 2005, 27(1): 116-119.

　　[4] 张  平, 章崇杰, 刘  杰, 等. 改良MTT法检测杀伤细胞的活性[J]. 华西医科大学学报, 1996, 27(2): 213-215.

　　[5] 梁春敏, 吴敏毓, 夏礼斌. 玉屏风散对小鼠白细胞活化作用的血清药理学研究[J]. 皖南医学院学报, 2001,  20(4): 251-253.

　　[6] 梁春敏, 王贤喜, 董  群, 等. 玉屏风散对小鼠免疫调节作用的血清药理学研究[J]. 上海免疫学杂志, 2003, 23(6): 385-388.

　　[7] 王  颖, 张惠珍, 王树军, 等. 鳖血提取物对小鼠免疫功能正向调节作用的研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(1): 123-125.

　　[8] 章  梅, 夏  天, 张仲海, 等. 四君子汤对脾虚患者血浆细胞因子的影响[J]. 第四军医大学学报, 2000, 21(4): 411-413.

　　[9] 周  华, 陈建南, 刘  良, 等. 作用温和中药复方药效学评价的药理模型探讨[J]. 中药新药与临床药理, 2000, 11(6): 377-379.