胎盘免疫调节因子对CIK细胞活性的影响
作者：蒙怡, 舒雨雁, 张学荣, 宋慧, 刘海涛
【关键词】 胎盘免疫调节因子;,细胞因子诱导的杀伤细胞;,细胞毒作用;,淋巴细胞增殖
[摘 要] 目的: 探讨胎盘免疫调节因子（placental factor, PF）对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells, CIK)的增殖及CIK细胞杀伤活性的影响。方法: 抽取健康人新鲜血液, 诱导CIK细胞产生后, 设加入不同浓度的PFCIK组和不加PF的空白CIK组, 观察CIK细胞的增殖率和细胞毒活性的变化。结果: 与不加PF的空白CIK细胞相比较, 加不同浓度的PF组CIK细胞的增殖率和杀伤率均有统计学差异（P<0.01）。结论: PF可上调节CIK细胞的生长及杀伤活性, 为CIK细胞的过继性免疫提供了一种新的方法。
[关键词]胎盘免疫调节因子; 细胞因子诱导的杀伤细胞; 细胞毒作用; 淋巴细胞增殖
胎盘免疫调节因子( placental factor, PF), 即胎盘肽, 是从健康孕妇足月分娩的胎盘中分离提取的小分子多肽及核酸为主的混合物质, 其相对分子质量(Mr)为3800～5000, 呈淡黄色透明液体[1]。近年临床使用中发现, PF 能提高机体的免疫功能, 具有良好的免疫调节和免疫增强作用[2], 能抑制肿瘤生长和抗突变, 促进淋巴细胞上绵羊红细胞受体恢复, 促进T细胞增殖、 分化和成熟并增强其活性。但迄今尚未有关于PF对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）功能的影响的报道, 为此, 本实验中探讨了PF对CIK细胞增殖及杀伤活性的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 重组人IFNγ和IL1α为Peprotech公司产品。重组人IL2和抗人CD3单克隆抗体（mAb）为北京远策药业有限公司产品。PHA、 RPMI1640培养基干粉为美国GIBCOBRL公司产品。胎牛血清和人淋巴细胞分离液为天津TBD公司产品。MTT购于Sigma公司。ATP荧光发光试剂盒为北京金紫晶生物医药技术有限公司产品。二甲基亚砜（DMSO）购于晶美公司。慢性粒细胞性白血病细胞株（K562细胞）购自上海细胞库。FITC标记的抗CD3 mAb和PE标记的抗CD56 mAb购自Pharmingen公司。
1.2 方法
1.2.1 PF的制备 按照刘月新等［1］ 报道的方法稍加改进制成。经紫外分光光度法检测, PF中蛋白质含量为1 g/L。
1.2.2 CIK细胞的制备 抽取健康自愿者的静脉血20 mL, 用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC）, 加RPMI1640培养液调整细胞的密度至1×109个/L, 于50 mL培养瓶中培养。于当天加入IFNγ（1×106 U/L）, 放置37℃、 50 mL/L CO2孵育箱中培养24 h。次日, 将悬浮的细胞转移到6孔板培养中, 分别加入终浓度为100 mg/L的PHA、 3×105 U/L IL2、 133 μg/L抗CD3 mAb及1×105 U/L IL1α, 每3 d半量换液1次, 同时补加IL2至3×105 U/L。以此方法诱导培养7 d后, 收获细胞, 用FITC标记的抗CD3 mAb及PE标记的CD56 mAb, 采用流式细胞术鉴定具有CIK细胞表型特征的CD3+ CD56+细胞。
1.2.3 PF对CIK细胞增殖的影响 将培养7 d的CIK细胞数调整至2×109个/L。于96孔板中每孔加入CIK细胞悬液和不同稀释度（1∶2~1∶32）的PF液各100 μL, 每组设3个平行对照孔, 置37℃、 50 mL/L CO2孵育箱中培养72 h, 用ATP荧光发光法测定淋巴细胞的增殖（ATP的荧光强度与活细胞的数量呈正比）。
1.2.4 CIK细胞杀伤活性的检测 将培养7 d的CIK细胞分为A、 B两组, A组为只加CIK细胞悬液的对照组; B组又分为5个浓度组, 在CIK细胞悬液中加入终浓度分别为1∶4、 1∶8、 1∶16、 1∶32、 1∶64的PF。于37℃、 50 mL/L CO2孵育箱中培养72 h后, 分别收集A、 B组中的CIK细胞, 并调整细胞密度为2×109/L。另外, 将培养至对数生长期的K562细胞数用RPMI1640培养液调整至1×108个/L。将A、 B组中的CIK细胞分别与K562细胞混合后, 按20∶1的效靶细胞比加入至96孔板中, 每组均设5个平行孔, 置37℃、 50 mL/L CO2孵育箱中培养12 h。每孔加入20 μL MTT继续培养4 h。离心弃上清, 每孔加入150 μL DMSO, 充分混匀溶解结晶后, 用酶标仪于波长490 nm测定A值, 并CIK细胞的杀伤率（%）。杀伤率=[1－（实验组的A值－单独效应细胞组的A值）/单独靶细胞组的A值]×100%。
1.2.5 统计学处理 采用SPSS for windows 统计软件包对数据进行统计学处理。计量资料数据用均数±标准差表示; 组间的差异采用多个样本均数的两两比较和两个样本均数的比较, 检验水准α＝0.05。
2 结果
2.1 PF对CIK细胞增殖的影响 加不同浓度PF的CIK细胞及不加PF的CIK细胞培养72 h后, 不加PF的对照组ATP的荧光强度为498.66; 而加PF的各组在PF的浓度为1∶16～1∶32的范围内, ATP的荧光强度随PF浓度的增加而增强。PF的浓度为1∶16时, ATP的荧光强度达到最高值3945.33, 以后虽然PF的浓度增加, 但ATP的荧光强度却逐渐下降, 浓度在1∶8时为2860.00, 1∶4时为1569.33, 于1∶2时为26400。经对多个样本的均数两两比较, 不同浓度的PF组间CIK细胞的增殖率具有显著差异（P<0.01, 图1）。
图1 PF对CIK细胞增殖的影响（略）
2.2 不同浓度的PF对CIK细胞杀伤活性的影响 与不加PF的对照相比较, 加入不同浓度的PF的CIK细胞的杀伤率明显增强（P<0.01）。PF的稀释度为1∶32和1∶64时, CIK细胞杀伤率较强（分别为空白的86.50%和83.59%）,明显高于对照组的55.28%（P<0.01）。随着PF稀释度的降低, CIK细胞的杀伤率逐渐下降, 说明CIK细胞杀伤活性与PF的浓度呈正相关关系（表1）。
表1 PF对CIK细胞杀伤活性的影响（略）
bP<0.01 vs PF原液及1∶4~1∶64的PF.
3 讨论
PF的理化性质与转移因子相似, 其生物学作用也与转移因子及胸腺肽有一定程度的相似; 但在免疫调节方面, PF的作用强于后两者, 并且无毒副作用。临床上, PF主要用于病毒性肝炎及支气管哮喘的、 抗肿瘤的辅助治疗。此外, 对重症肌无力和银屑病、 外阴营养不良等机体免疫紊乱引起的疾病也有明显疗效, 因此, PF是一种非常有研究价值的免疫调节剂[3]。CIK细胞是一类非MHC和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞, 其主要表型为CD3+CD56+[4]。在培养过程中, 多种细胞因子的刺激, 均可激活CIK细胞发挥细胞毒作用。CIK细胞具有增殖快、 杀瘤活性高及杀瘤谱广等特点, 较LAK和NK细胞的杀伤活性更强[5]。ATP荧光发光法是近年起来的一种针对测定的细胞数可进行较高评估的新方法[6, 7]。ATP法检测活细胞数的原理是, ATP为活细胞最基本的能量来源, 其水平与活细胞数呈线性正相关关系。用荧光素荧光素酶试验定量测定细胞中内源性ATP 的含量时, 在有氧条件下, 荧光素酶可与其底物结合后可催化ATP 转变成ADP, 并释放波长为562 mm的荧光, 根据其产生的荧光强度可直接反映细胞的数量。与MTT比色法相比较, ATP法更加敏感、 准确、 快速; 但由于试剂和仪器价格昂贵, 其在国内使用还不够普遍。本实验中, 为探讨PF对CIK细胞增殖与杀伤活性的影响, 设计了不同浓度的PF组, 发现CIK细胞的增殖与PF的浓度具有依赖关系。在PF的稀释度为1∶2~1∶32的范围内, CIK细胞的增殖呈抛物线形, 于稀释度为1∶16时, 达最高峰。在PF对CIK细胞杀伤活性影响方面, 发现加PF的各组CIK细胞杀伤率均高于不加PF的对照组, PF的稀释度为1∶32时杀伤率最高。关于PF影响CIK细胞的活性的作用机制尚不明确。此外, 由于PF为一种混合物, 其中发挥主要作用的成分尚未确定, 值得进一步研究。
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[1] 刘月新, 李勋楚, 段茂芳, 等. 一种新的免疫调节剂――胎盘因子的制备与研究[J]. 免疫学杂志, 1985, 5 (1): 51.
[2] 许代娣, 李 琪. 胎盘免疫调节因子的研究现状[J]. 广西医科大学学报, 1999, 16 (2): 228-230.
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