醛固酮对肾小球系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白和TGF
【关键词】 醛固酮;,肾小球系膜细胞;,纤维连接蛋白;,转化生长因子β1
Effects of aldosterone on synthesis of fibronectin and expression of transforming growth factorβ1 mRNA in cultured rat mesangial cells
[Abstract] AIM: To evaluate the effect of aldosterone (ALD) and spironolactone (SPI, one of the aldosterone receptor antagonists) on synthesis and secretion of fibronectin (FN) and expression of transforming growth factorβ1 (TGFβ1 ) mRNA in cultured rat mesangial cells. METHODS: (1)Mesangial cells were treated with medium containing different concentrations of ALD (10-11, 10-9, 10-7 mol/L) and/or 10-7 mol/L SPI for 48 h, while control cells were treated with vehicle only. The levels of FN in the supernatants were measured by ELISA method. The expressions of FN mRNA and TGFβ1 mRNA were detected by semiquantitative RTPCR. (2)Mesangial cells were treated with 10-9 mol/L ALD for 24, 48, 72 h. The levels of FN in the supernatants were measured by ELISA method. The expressions of FN mRNA and TGFβ1 mRNA were detected by semiquantitative RTPCR. RESULTS: ELISA method showed that the level of FN in the supernatant of cultured rat mesangial cells stimulated with ALD increased significantly in a dose and timedependent manner. Also the expressions of FN mRNA and TGFβ1 mRNA were increased significantly by ALD in a dose and timedependent manner by semiquantitative RTPCR. SPI inhibited the stimulating effect of ALD on synthesis of FN and expressions of FN mRNA and TGFβ1 mRNA in cultured rat mesangial cells. CONCLUSION: ALD upregulates the protein synthesis and mRNA expression of FN, and upregulates the mRNA expression of TGFβ1 in cultured rat mesangial cells. SPI inhibits the effect of ALD, and thus implication in the treatment of Glomerulosclerosis.
[Keywords]aldosterone; mesangial cells; fibronectin; TGFβ1
[摘 要] 目的: 研究醛固酮（ALD）及其受体拮抗剂螺内酯（SPI）对大鼠肾小球系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白（FN）, 以及对转化生长因子β1(TGFβ1 ) 基因表达的影响。方法: (1)以不同浓度的ALD (10-11、 10-9、 10-7 mol/L) 及/或 10-7 mol/L SPI刺激肾小球系膜细胞48 h后, 用ELISA法测定培养上清中FN的浓度。用半定量RTPCR法检测该细胞中FN mRNA和TGFβ1 mRNA 的表达。(2)以10-9 mol/L的ALD刺激系膜细胞不同时间 （24、 48、 72 h）后, 分别用上述方法测定培养上清中FN的浓度和细胞中FN mRNA和TGFβ1 mRNA 的表达。 结果: (1)ELISA的结果显示, ALD可促进系膜细胞合成分泌FN, 且呈剂量和时间依赖性, SPI能拮抗ALD的作用。(2)半定量RTPCR的结果显示, ALD可促进系膜细胞FN mRNA和TGFβ1 mRNA的表达, 也呈剂量和时间依赖性, SPI也能拮抗ALD的作用。结论: ALD在蛋白和基因水平上均可促进大鼠肾小球系膜细胞合成分泌FN, 及TGFβ1 mRNA的表达, SPI能拮抗ALD的作用, 具有一定的肾脏保护作用, 从而有益于延缓肾小球硬化的进展。
[关键词]醛固酮; 肾小球系膜细胞; 纤维连接蛋白; 转化生长因子β1
近年来, 肾素血管紧张素醛固酮系统(reninangiotensinaldosterone system, RAAS) 在慢性肾脏疾病进展中的作用越来越受到重视, 血管紧张素II是这一系统中造成肾脏损害的主要物质。最近动物实验表明, 醛固酮(ALD)也是这一系统中造成肾脏损害的重要物质, ALD可能通过血流动力学改变和直接作用于肾脏固有细胞发挥作用, 其作用机制目前尚未完全明了［1］。肾小球系膜细胞是肾小球固有细胞中合成细胞外基质最强的细胞, 是导致肾小球硬化的特殊间质效应细胞。本实验利用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞, 研究了ALD及其受体拮抗剂螺内酯（SPI）对系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白（FN）, 以及对转化生长因子β1(TGFβ1 ) mRNA表达的影响, 以探讨ALD在肾小球疾病中的作用, 并为临床应用SPI慢性肾小球疾病提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 DALD、 SPI购自Sigma公司。大鼠FN ELISA试剂盒购自上海太阳公司。Trizol总RNA提取试剂及逆转录（RT）试剂盒购自Invitrogen公司。其他试剂为国产分析纯。80~120 g雄性SD大鼠购自北京大学医学部实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 培养上清FN浓度的ELISA法测定 参照[2]的方法对SD大鼠的肾小球系膜细胞进行原代培养、 传代和细胞鉴定。取第6～8代的细胞用于实验。用含100 mL/L FCS的RPMI1640培养液将细胞制成单个细胞悬液(5×107个/L), 按每孔1 mL接种于24孔板中。培养72 h后, 换成含5 mL/L FCS的RPMI1640培养液再培养24 h, 使细胞处于静止期（G0期）。(1)剂量效应的检测: 实验分为A、 B、 C、 D 4组, A组（对照组）: 加入等体积(1mL)的含100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液; B组: 加入含有不同浓度（10-11、 10-9、 10-7 mol/L）ALD的RPMI1640培养液; C组: 加入含有10-7 mol/L SPI的RPMI1640培养液; D组: 加入含有10-9 mol/L ALD和10-7 mol/L SPI的RPMI1640培养液(SPI的加入应先于ALD 2 h)。培养48 h后收集细胞培养上清。(2)时间效应的检测: 实验分为E、 F两组, E组(对照组): 加入等体积的含100 mL/L FCS的RPMI1640培养液; F组: 加入含有10-9 mol/L ALD的RPMI1640培养液。培养24、 48、 72 h后, 收集细胞培养上清。用ELISA法检测细胞培养上清中FN的含量（按试剂盒的说明书操作）。以上两项检测中每组均设4个复孔, 实验均重复2次。
1.2.2 系膜细胞中FN和TGFβ1 mRNA的半定量RTPCR检测 将系膜细胞培养于100 mL培养瓶中, 培养72 h后, 换成含5 mL/L FCS的RPMI1640培养液再培养24 h使细胞处于静止期（G0期）。实验的分组同1.2.1项。细胞总RNA的提取按Trizol试剂盒的说明书操作。用752型紫外分光光度计测定波长260、 280 nm的吸光度(A值)。按A260/A280＞1.8, 其含量。cDNA第1链的合成: 应用Invitogen公司提供的SuperScriptTM FirstStrand Synthesis System for RTPCR试剂盒进行, 反应总体积为20 μL。引物的设计参照有关文献[3-5], 由上海生工公司合成。扩增FN基因（272 bp）引物的序列, Sense为: 5′CAG TTT GTG GAA GTG ACC GA3′, Antisense为: 5′TGG AGG TTA GTG GGA GCA TC3′。扩增GAPDH基因（452 bp）引物的序列, Sense为: 5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′, Antisense为: 5′TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3′。扩增TGFβ1基因（498 bp）引物的序列, Sense为5′AAT ACG TCA GAC ATT CGG GAA GCA3′, Antisense为5′GTC AAT GTA CAG CTG CCG TAC ACA3′。扩增GAPDH基因（349 bp）引物的序列, Sense为5′CAT GGT CTA CAT GTT CCA GT3′, Antisense为5′GGC TAA GCA GTT GGT GGT GC3′。扩增FN基因的PCR反应条件为: 先于94℃变性3 min, 然后94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共30个循环后, 再于72℃延伸7 min。扩增TGFβ1基因的PCR反应条件为: 先于94℃变性3 min, 然后于94℃ 45 s, 58℃ 45 s, 72℃ 1 min, 共30个循环后, 再于72℃延伸7 min。分别取6 μL PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶在UVP凝胶成像系统中扫描观察结果并拍照, 分析电泳带灰度, 计算目的基因与内参GAPDH基因扩增带灰度之比值, 即得目的基因mRNA的表达量。
1.2.3 统计学分析 数据均用x±s表示, 使用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。两样本均数的比较采用独立样本t检验; 多个样本均数的比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）, 多个样本均数间每两个均数的比较根据方差齐性检验（HomogeneityofVariance）。若总体方差齐, 选择Bonferroni法分析; 若方差不齐, 选择Tamhane’s T2法分析。
2 结果
2.1 ALD对培养的大鼠肾小球系膜细胞合成分泌FN的影响 随着ALD浓度的升高, 系膜细胞培养上清中FN的含量逐渐升高。ALD的浓度在10-7 mol/L时, FN的含量最高, 与对照组比较, 差异有统计学意义（P<001）, 表明ALD可促进系膜细胞合成分泌FN, 且呈剂量依赖性。10-7 mol/L SPI组FN的含量与对照组相比较差异无统计学意义（P>005）。10-7 mol/L SPI与10-9 mol/L ALD共同作用于系膜细胞48 h, FN的含量与对照组相比较, 差异也无统计学意义（P>005）; 但与10-9 mol/L ALD组相比较, 差异有统计学意义（P<005）, 表明SPI能够拮抗ALD的作用（表1）。另外, 随着作用时间的延长, 培养上清中FN的含量逐渐升高。48 h和72 h组与对照组相比较, 差异有统计学意义（P<001）, 表明ALD可促进系膜细胞合成分泌FN, 并具有时间依赖性（表2）。
表1 不同浓度的ALD和SPI刺激对培养48 h的肾小球系膜细胞培养上清中FN水平的影响（略）
Tab 1 The effects of different concentrations of ALD and SPI stimulation on FN level in culture supernatant of mesangial cells cultured for 48 hours
bP<0.01 vs control group; aP<0.05 vs 10-9 mol/L ALD group.
表2 10-9 mol/L ALD作用不同时间对培养的肾小球系膜细胞上清中FN水平的影响（略）
Tab 2 The effects of different times of 10-9 mol/L ALD stimulation on FN level in culture supernatant of mesangial cells
bt=-4.216, bP<0.01; dt=-3.782, dP<0.01 vs control group, respectively.
2.2 ALD对培养的大鼠肾小球系膜细胞FN mRNA表达的影响 随着ALD浓度的升高, FN mRNA的表达量（以FN/GAPDH mRNA表示）明显增加, 分别为对照组的111、 146和168倍（P<001）, 表明ALD可促进系膜细胞FN mRNA的表达, 且具有剂量依赖性。10-7 mol/L的SPI组FN mRNA的表达量与对照组相比较, 差异无统计学意义（P>005）。10-7 mol/L SPI与10-9 mol/L ALD共同作用于系膜细胞48 h, FN mRNA的表达量与对照组相比较差异无统计学意义（P>005）, 但与10-9 mol/L ALD组相比较, 差异有统计学意义（P<005）, 说明SPI能拮抗ALD的作用（表3）。随着作用时间的延长, FN mRNA的表达量明显增加, 分别为对照组的118、 156及167倍（P<005）, 表明ALD促进系膜细胞FN mRNA的表达, 且具有一定的时间依赖性（表4）。
表3 不同剂量ALD对肾小球系膜细胞中FN mRNA的表达（略）
Tab 3 The effects of different doses of ALD on FN mRNA expression in mesangial cells
aP<0.05, bP<0.01 vs control group; cP<0.05 vs 10-9 mol/L ALD group.
表4 ALD作用不同时间对系膜细胞中FN mRNA表达的影响（略）
Tab 4 The effects of different times exposure to ALD on FN mRNA expression in mesangial cells
aP<0.05, bP<0.01 vs control group.
2.3 ALD对培养的大鼠肾小球系膜细胞中TGFβ1 mRNA表达的影响 随着ALD浓度的升高, TGFβ1 mRNA的表达量（以TGFβ1/GAPDH mRNA表示）明显增加, 分别为对照组的1.18、 1.24及1.46倍（P<001）, 表明ALD可促进系膜细胞TGFβ1 mRNA的表达, 且具有剂量依赖性。10-7 mol/L的SPI组TGFβ1 mRNA的表达量稍降低, 但与对照组相比较无统计学差异（P>0.05）。10-7 mol/L SPI与10-9 mol/L ALD共同作用于系膜细胞48 h, TGFβ1 mRNA的表达量与对照组相比较无统计学差异（P>005）, 但与10-9 mol/L ALD组相比较有统计学差异（P<005）, 说明SPI能够拮抗ALD的作用（表5）。随着作用时间的延长, TGFβ1 mRNA的表达量明显增加, 分别为对照组的112、 118及132倍（P<001）, 表明ALD可促进系膜细胞TGFβ1 mRNA的表达, 且具有一定的时间依赖性（表6）。
表5 ALD对肾小球系膜细胞TGFβ1 mRNA的表达（略）
Tab 5 The effect of different doses of ALD on TGFβ1 mRNA expression in mesangial cells
aP<0.05, bP<0.01 vs control group; cP<0.05 vs 10-9 mol/L ALD group.
表6 ALD作用不同时间对肾小球系膜细胞TGFβ1 mRNA的表达（略）
Tab 6 The effects of different times exposure to ALD on TGFβ1 mRNA expression in mesangial cells
aP<0.05, bP<0.01 vs control group.
3 讨论
许多因素均能刺激肾小球系膜细胞活化, 合成分泌多种炎症介质及细胞外基质(ECM), 导致肾小球炎症和硬化, 促进肾脏疾病进展。因此, 研究ALD对肾小球系膜细胞ECM及炎症介质的影响, 对于阐明ALD在肾小球炎症、 硬化及肾脏纤维化机制中的作用至关重要。FN是ECM的主要组成成分之一, 具有明显的结合纤维蛋白、 纤维蛋白原和胶原的能力。在正常肾组织中表达量较低, 但在病理情况下表达量明显增高。很多因素都可直接促进肾小球系膜细胞合成分泌FN, 如TGFβ1［6］、 血管紧张素II、 高糖以及其他一些细胞因子等, 但尚未见ALD影响肾小球系膜细胞合成分泌FN的报道。本研究表明, ALD可促进大鼠肾小球系膜细胞合成分泌FN, 以及FN mRNA的表达, 具有一定的剂量依赖和时间依赖性, 提示ALD在蛋白和基因水平上均可促进肾小球系膜细胞合成分泌FN, 从而促进肾小球硬化的进展。ALD的这一作用能被醛固酮受体拮抗剂SPI所抑制, 说明ALD是通过与其受体结合发挥作用的。因SPI可阻止醛固酮受体激活而抑制ALD的作用, 故对肾脏具有一定的保护作用。
TGFβ1已被公认是导致ECM积聚的重要的细胞因子, 在肾小球炎症和硬化中起着重要作用。TGFβ1可刺激肾小球系膜细胞合成分泌I、 IV型胶原、 FN、 层黏连蛋白及蛋白聚糖等。另外, TGFβ1还能通过抑制蛋白酶的合成和促进蛋白酶抑制剂的生成, 从而减少ECM的降解。很多因素可刺激肾小球系膜细胞合成分泌TGFβ1, 如血管紧张素II、 高糖、 高血脂等。然而, ALD是否通过促进肾小球系膜细胞TGFβ1的产生, 从而导致肾小球疾病的进展？目前尚未见报道。本研究结果表明, ALD可以剂量及时间依赖形式地促进大鼠肾小球系膜细胞TGFβ1 mRNA的表达, 进而导致肾小球硬化及纤维化, 因醛固酮受体拮抗剂SPI能抑制ALD的作用, 因而对肾脏具有一定的保护作用。
综上所述, 我们认为, 慢性肾衰竭时高ALD血症是毁损残余肾功能的因素之一, ALD通过促进TGFβ1的产生和ECM的积聚, 促进肾小球硬化的进展, 从而导致残余肾功能进一步下降。醛固酮受体拮抗剂SPI能够抑制ALD的作用, 应用醛固酮受体拮抗剂有可能延缓肾小球硬化的进展。本研究为进一步探讨ALD在肾小球疾病中的作用奠定了一定的基础, 也为临床应用醛固酮受体拮抗剂慢性肾脏病提供了一定的实验依据。
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