兔抗人细胞色素P450 4A11合成肽抗体的制备与鉴定

            作者：杨微, 刘海英, 武正华, 唐晓波, 朱大岭

【关键词】  CYP4A11;,合成肽;,多克隆抗体

　　[摘 要]  目的: 制备兔抗人细胞色素P450 4A11 （CYP4A11）抗体, 并对其特性进行初步鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列, 根据亲水性结构、   柔韧区、 抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、 合成CYP4A11多肽, 与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联, 免疫大耳白兔制备抗CYP4A11抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体, 对纯化的抗体进行ELISA、 Western blot、 免疫组化等鉴定。结果: 获得抗CYP4A11合成肽的抗体。该抗体效价为1∶32000。可与CYP4A11合成肽及天然CYP4A11出现特异性反应, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为53000, 可识别正常肝脏的CYP4A11。结论: 合成的多肽KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、 Western blot、 免疫组化等实验。

　　[关键词]CYP4A11; 合成肽; 多克隆抗体

　　人细胞色素P450 4A11是细胞色素P450 4A亚型之一, 主要分布在肝脏和肾脏, 其可以催化多种脂肪酸（月桂酸等）的代谢, 调节体内脂类代谢平衡[1]。CYP4A11催化内源性花生四烯酸代谢生成20羟基廿碳四烯酸（20H ydroxyeicosatetraenoicacid, 20HETE）, 而20HETE与原发性高血压形成有关[2]。CYP4A11还参与防御紫外线氧化损伤的机制[3]。目前对CYP4A11的研究正逐渐深入。国外已研究出重组CYP4A11抗体, 而国内尚无这方面报道。因此, 我们制备CYP4A11的抗体, 这将对CYP4A11的生理功能、 组织定位以及与某些疾病的关系研究起重要的推动作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  雄性大耳白兔6周龄, 由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）均购自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购自Jackson Immuno Research公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物科技有限公司完成。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。

　　1.2  方法
　　
　　1.2.1  CYP4A11合成肽的设计  利用DNAStar软件根据抗原指数(Antigenic Index)、 亲水性结构（Hydrophilicity Plot）、 柔韧区(Flexible Regions)及表面概率结构(Surface Probability  Plot)4个参数综合分析CYP4A11序列的特点, 确定505～519位15个氨基酸为欲合成的肽序列: RLRRLPNPCEDKDQL。

　　1.2.2  CYP4A11肽的合成及其与KLH和BSA的交联  CYP4A11合成肽由北京中科亚光生物科技有限公司采用合成肽自动合成仪合成; 获得的合成肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化, 纯度为96.9%。CYP4A11与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法, 将5 mg合成肽分别加入7 mg KLH和BSA中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L的戊二醛溶液（1 mL）, 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜, 交联形成CYP4A11KLH、 CYP4A11BSA偶联物。

　　1.2.3  兔抗CYP4A11合成肽抗体的制备  取200 μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射, 每点约100 μg。2 周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射; 以后隔2周加强免疫1次; 从第3次加强免疫开始, 每次免疫后7 d, 经耳中央动脉采血测定抗体的效价, 经过4次加强免疫后符合要求时, 立即颈动脉采血, 分离血清后, 无菌分装保存于-80℃备用。

　　1.2.4  人肝脏微粒体蛋白制备  取正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。采用差速离心（4℃,10000 g离心30 min, 取上清液30000 g离心60 min, 取上清100000 g离心60 min）, 沉淀悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200 mL/L甘油, 5 g/L胆酸钠, 2 mg/L抑肽酶, 2 mg/L亮肽素, 1 mg/L胃酶抑素及1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中, 用Bradford法进行蛋白定量后, 置-80℃保存备用。

　　1.2.5  辛酸硫酸铵法纯化合成肽抗体  用醋酸钠缓冲液（60 mmol/L, pH4.0）将抗血清稀释3～4倍, 0.1 mol/L NaOH调节pH至4.5, 缓慢滴加辛酸至浓度为25 mL/L, 室温搅拌30 min。4℃ 10 000 g离心30 min, 弃沉淀后滤膜（0.22 μm）过滤, 加入1/10体积的10×PBS, 用0.1 mol/L NaOH调节pH至7.4, 缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45%饱和度, 混合后4℃过夜。4℃ 3000 g离心30min, 弃上清后, 用0.01mol/L PBS（pH7.4）重悬, 透析过夜。用Branford法进行蛋白定量。经SDSPAGE分离后,    用BIORAD quantity one软件分析其纯度。

　　1.2.6  ELISA检测抗血清效价  分别用人肝微粒体蛋白和合成肽BSA偶联物以1 mg/L的浓度包被ELISA检测板, 每孔100 μL, 4℃孵育过夜后, 用10 mL/L小牛血清封闭, 37℃ 2 h后, 洗涤备用。取出包被好的检测板, 每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100 μL (对照为正常兔血清), 37℃孵育30 min, 洗涤3次后每孔加入1∶5000 稀释的HRP 标记的羊抗兔IgG 100 μL, 37℃孵育15 min,     洗涤3次后进行TMB显色, 37℃孵育15 min, 终止反应后, 用酶标仪测定样品的A450值。

　　1.2.7   间接ELISA检测抗体相对亲和常数  用合成肽交联BSA分别以5 mg/L和10 mg/L的浓度包被ELISA检测板, 封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体, 再加入HRP 标记的羊抗兔IgG二抗, TMB显色测定A450 。以抗体浓度的对数为横坐标, A值为纵坐标作图。以曲线达到水平时的A值为100%, 求出A50即50% A值对应的抗体浓度[4]。按照Kaff=(n－1)/2(n[Ab’] t－2[Ab] t) 算出抗体亲和常数, 其中[Ab’] t 、 [Ab] t指的是A50时即包被抗原分别为5 mg/L和10 mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度, [Ag] t、 [Ag’] t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10 μg和5 μg, n=[Ag] t/[Ag’] t, 本实验中n=2。

　　1.2.8  Western blot鉴定多克隆抗体的特异性  采用合成肽竞争法鉴定多克隆抗体的特异性, 用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、 合成肽BSA及BSA, 于95℃加热5 min, 置于冰上冷却10 min。上样量分别为70、 15和15 μg, 然后以标准蛋白marker为中心两侧对称同时上样, 经SDSPAGE分离后, 以湿转法电转至NC膜上。经脱脂奶粉封闭（室温1 h）后, 在marker处剪开, 两边分别加入1∶1000稀释纯化后抗体和1∶1000稀释纯化后抗体+等量合成肽（4℃过夜, 以0.5 mL/L Tween20 TBS洗膜3次）, 然后加入1∶10000 HRP山羊抗小鼠IgG（室温孵育1 h,   以0.5 mL/L Tween20 TBS洗膜3次）。用化学发光剂试剂盒（ECL Plus）处理5 min后, 于暗室曝光到X光胶片上显影、 定影。

　　1.2.9  多克隆抗体的免疫组化染色  取出用丙酮固定的冰冻人肝脏和肾脏组织切片, 滴加50 mL/L BSA, 室温下封闭20 min, 加入1∶1000 稀释兔抗人CYP4A11多肽抗体, 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgGHRP, 37℃孵育20 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后, 脱水、 透明、 封片, 镜检, 放大400倍拍照记录结果[5]。

　　2  结果

　　2.1  CYP4A11的氨基酸序列分析  用DNAStar软件根据亲水性结构、 柔韧区、 抗原指数及表面概率结构4个参数对氨基酸序列进行综合分析（图1）。预测的结果进行综合考虑, 选取欲合成的肽序列为505～519位氨基酸（图中阴影区）: RLRRLPNPCEDKDQL。

　　图1  DNAstar软件对人CYP4A11蛋白序列参数的预测（略）

　　2.2  CYP4A11合成肽抗原的合成与纯化  化学合成的多肽经HPLC 纯化后, 纯度可达96.9%, 交联KLH后可作为抗原免疫动物。

　　2.3  抗血清的特性鉴定  ①效价测定: 间接ELISA检测显示, 抗血清与人肝微粒体蛋白及合成肽BSA交联物的反应效价分别为1∶8000和1∶32000。②相对亲和力常数测定（图2）: 用间接ELISA测定纯化后抗体的亲和常数10-5～10-6 M-1。③抗体特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白、 合成肽BSA、 BSA作为抗原, 以兔抗血清作为一抗进行Western blot分析显示, 抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr大约为53000处出现1条清晰带, 与CYP4A11的Mr相符, 由于是多克隆抗体, 又出现一条非特异结合条带; 与合成肽BSA在Mr大约为69000处出现1条清晰带, 与BSA的Mr相符; 而与BSA则无条带出现（图3）。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP1A2蛋白结合。而在加入CYP4A11合成肽竞争反应的一侧, 相应条带均明显消失或变浅, 这也进一步证实制备的抗体即为抗CYP4A11合成肽的抗体。

　　2.4  多克隆抗体的免疫组化定位  CYP450位于细胞的线粒体内膜和内质网上, 经免疫组化实验证明, 胞质明显着色, 而细胞核没有着色。由此证明, 抗CYP4A11的抗体可以与正常肝脏组织中的CYP4A11蛋白结合。
 
　　图2  多克隆抗体的相对亲和力分析（略）

　　图3  抗血清特异性的Western blot分析（略）

　　M: 预染蛋白梯; 1, 6: CYP4A11BSA; 2, 5: BSA; 3, 4: 人肝微粒体蛋白; 46: 一抗加入合成肽竞争.

　　图4  抗CYP4A11多肽多克隆抗体免疫组化分析（略）

　　A: 正常肝脏组织HE染色(×200); B: 箭头所示为血管内皮, 无着色(×100); C: 箭头所示处, 镜下可见明显棕黄色颗粒(×400).

　　3  讨论

　　细胞色素P4504A（CYP4A）主要催化脂肪酸代。脂肪酸代谢途径对结肠癌有重要的致癌作用[6]。因此, CYP4A作为长链脂肪酸的代谢酶具有重大研究意义。而抗体作为研究蛋白质的重要工具, 具有重大的应用价值。我们应用机软件分析和生物信息学技术, 从蛋白的一级结构分析推导出蛋白的主要表位, 并用化学方法合成多肽作为抗原是制备抗体的一种快速的方法, 同时制备的抗体纯度高、 稳定性强。但是由于它只能线性表达, 不能折叠, Mr太小, 免疫原性较差, 因此必须与合适的载体连接成复合物, 以提高其免疫源性。我们采用KLH为载体, 获得较好的免疫源性。对于氨基酸序列的选择, 我们根据亲水性结构、 柔韧区、 抗原指数及表面概率结构4个参数进行综合分析,    选取末端的连续片断作为合成肽序列, 因为末端比中间序列的柔韧性和亲水性更好, 且肽段长度与抗原性呈正比[7], 所以最终合成肽确定505～519之间的15个氨基酸残基。抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的强度[8]。多克隆血清是含有不同亲和力抗体的复杂混合物, 因此, 多克隆血清的亲和力不能精确测定下来, 但可确定其平均相对亲和力。本实验中获得纯化后抗体的相对亲和常数在10-5～10-6 M-1, 对确定抗体的用途, 验证抗体的均一性等均有重要价值。获得的抗血清与人肝微粒体蛋白的免疫印迹分析结果显示2条特异性条带, 一条Mr是53000, 另一条大约是90000。我们认为Mr是90000的条带可能是CYP4A11的二聚体。随着对CYP4A11研究的逐渐深入, 我们制备的高效价、 特异性强的兔抗人CYP4A11合成肽的抗体, 为CYP4A11生理功能的研究及进一步探讨CYP4A11与某些疾病的关系提供有力的工具。

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