两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5

           作者：马泓冰, 孙中文, 徐颖, 李文香, 陶然, 陈洁, 张学光

【关键词】  固相化金属螯合层析法;,凝胶过滤层析法;,纯化;,单克隆抗体

　　[摘 要]  目的: 建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)2F5的两步串联层析法。方法: 将含mAb 2F5的腹水经离心、 过滤及缓冲溶液变换预处理后, 先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)纯化, 去除大部分杂蛋白, 再经凝胶过滤层析法(gel filtration, GF)精细纯化, 并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对mAb 2F5纯度的影响。纯化的mAb 2F5的生物学活性用3HTdR掺入法进行分析。结果: 以两步串联层析法纯化的鼠抗人CD28 mAb 2F5的纯度大于90%, 总回收率达70%。纯化的mAb 2F5在体外对PBTC具有明显的促增殖作用; 而且其促增殖作用的活性优于Protein G亲和层析法（affinity chromatography, AC）纯化所获得mAb。结论: 建立的两步串联层析纯化方法操作简便, 所得mAb的纯度高、 生物学活性好。

　　[关键词]固相化金属螯合层析法; 凝胶过滤层析法; 纯化; 单克隆抗体

　　CD28分子在信号转导及自身免疫性疾病等中的作用已成为目前研究的热点[1, 2]。为了深入研究其功能, 本研究小组制备了鼠抗人CD28 单克隆抗体（mAb）2F5, 并研究了其纯化方法。目前纯化mAb的方法很多, 如离子交换[3]、 疏水层析[4]及亲和层析[5]等, 这些方法各有其优缺点, 固相化金属螯合亲和层析法（IMAC）是近年来起来的一项新型分离技术, 具有配基简单、 不易泄漏、 吸附量大、 分离条件温和及通用性强等优点, 已成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一[6], 但尚未见用于纯化小鼠腹水中mAb的报道。由于小鼠腹水中含有某些杂蛋白成分, 单独使用IMAC法时, 往往达不到较好的纯化效果, 通常需要串联其他层析法进行纯化才能获得高纯度的活性抗体[7]。我们采用IMAC与凝胶过滤（GF）两步串联的层析法, 对小鼠腹水中鼠抗人CD28 mAb 2F5进行了纯化。建立的方法具有操作简单、 mAb纯度高及生物学活性好等特点。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  含mAb 2F5的小鼠腹水由本室制备。外周血T细胞（PBTC）由通过Ficoll密度梯度法和磁珠阴性选择去除CD19、 CD56阳性细胞后获得。BioLogic DuoFlow中高压层析仪（检测波长为280 nm）、 IMAC层析柱（1.0 cm×3.2 cm, 内填装有末螯合Ni2+的填料）、 GF层析柱（1.0 cm×64 cm, P100填料, 分离范围5000～100100 Daltons）、 脱盐层析柱（2.5 cm×10 cm, P6填料, 分离范围1000～6000 Daltons）、 MiniProtean 3电泳仪、 SmartSpec3000紫外可见分光光度计、 Gel Doc1000凝胶成像系统及蛋白质Lowry法定量试剂盒, 均为BioRad公司产品。其他试剂均为分析纯试剂。

　　1.2  方法

　　1.2.1  IMAC层析柱纯化  将装填好的IMAC层析柱连接到层析仪上, 对IMAC填料进行Ni2+螯合(参见填料说明书)后, 用5倍柱体积（CV）的上样缓冲液A（以咪唑浓度梯度洗脱时, 上样条件为pH8.0的50 mmol/L PB+5 mmol/L咪唑; 其他洗脱条件时, 为pH8.0的50 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl）充分平衡层析柱。取含有mAb 2F5的小鼠腹水5 mL, 加入适量的SiO2粉末, 振荡30 min, 以9000 r/min离心20 min。取上清, 过0.22 μm滤膜, 加入到经缓冲液A平衡的脱盐柱并以缓冲液A做为流动相进行洗脱, 接收洗脱流份, 置4℃待用。取500 μL经上述预处理后的样品上样（流速依据实验条件的不同分别调整为0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min）, 用洗脱缓冲液B（洗脱条件依据实验条件的不同, 分别采用pH8.0～4.0的梯度、0～1.0mol/L NH4Cl的浓度梯度和10～300mmol/L咪唑的浓度梯度）进行洗脱。洗脱步骤为: 100%A液洗脱10CV, 用0%～100%B液洗脱10CV, 再用100%B液洗脱4CV, 洗脱流速为1.0 mL/min, 收集蛋白峰。

　　1.2.2  GF层析柱纯化  将装填好的GF层析柱连接到BioLogic DuoFlow中高压层析仪上, 用缓冲液（pH72的20 mmol/L PBS）充分平衡层析柱后, 以IMAC层析柱的洗脱馏份为样品上样, 上样及洗脱的流速均为0.2 mL/min, 收集蛋白峰。

　　1.2.3  纯化的mAb 2F5的SDSPAGE鉴定  取纯化的mAb 2F5样品在还原条件下进行SDSPAGE（分离胶浓度为100 g/L, 浓缩胶浓度为50 g/L）。电泳后, 以考马斯亮蓝R250染色, 再经凝胶成像仪扫描鉴定mAb 2F5的纯度。纯化的mAb 2F5的浓度采用Lowry法试剂盒进行定量。

　　1.2.4  mAb 2F5促进PBTC增殖的作用  采用3HTdR法。以激发型鼠抗人CD3 mAb（0.25 mg/L）包被96孔板（100 mL/孔）, 加入一定密度(5×106/mL)的细胞悬液（100 mL/孔）, 然后分别加入经IMAC+GF两步串联层析法及常规Protein G亲和层析法[9]纯化的不同浓度（0.1、 0.25、 0.5、 1.0、 2.5 mg/L）的mAb 2F5, 同时设小鼠IgG1同型及只加激发型抗CD3 mAb的对照组。培养56 h后, 加入3HTdR(3.7×104 Bq/孔), 继续培养至72 h, 采用液闪仪测定各孔的cpm值。

　　2  结果

　　2.1  mAb 2F5的纯化及鉴定  (1)IMAC层析柱上样流速的条件:  在PB缓冲溶液（pH 8.050 mmol/L+0.5 mol/L NaCl）条件下上经过预处理的腹水样品, 采用pH (8.0～4.0)梯度洗脱。分别试验了0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min的上样流速, 洗脱流速均为1.0 mL/min。结果表明, 目的蛋白均可与IMAC层析柱中螯合了Ni2+填料结合并被洗脱。在低流速（≤0.3 mL/min）下上样时, 穿透液中无目的蛋白成分, 而在高流速（>0.3 mL/min）条件下上样时, 则有目的蛋白成分穿透。考虑到纯化的效率, 最终选择的上样流速为0.3 mL/min。不同上样流速条件下纯化的mAb 2F5的SDSPAGE分析, 结果见图1。

　　图1  以不同上样流速条件进行IMAC柱层析纯化mAb 2F5的SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白marker; 1, 3, 5, 7: 以 0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min上样流速时的流出组分; 2, 4, 6, 8: 以 0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min上样流速时的洗脱组分.

　　（2）IMAC层析柱洗脱的条件: 在PB缓冲溶液（pH8.0 50 mmol/L+0.5  mol/L NaCl）条件下上经过预处理的腹水样品, 分别采用pH梯度（pH8.050 mmol/L PB+0.5  mol/L NaCl～pH4.050 mmol/L NaACHAC+0.5 mol/L NaCl）、 0～1.0 mol/L NH4Cl和10～300 mmol/L咪唑浓度梯度洗脱（以咪唑的浓度梯度洗脱时, 上样条件为pH8.050 mmol/L PB含5 mmol/L咪唑）。结果表明, 采用pH梯度洗脱时, 所得mAb的纯度高（80%, 凝胶成象仪扫描）、 回收率高（Lowry法测定腹水原液的蛋白浓度为54.1 g/L, 凝胶成象仪扫描鉴定其含IgG为10%, 图2洗脱峰2的蛋白浓度为2.08 g/L, 收集量为1.3 mL, 则回收率为2.08×1.3×80%/54.1×0.5×10%=80%）, 不同洗脱条件纯化的mAb 2F5的SDSPAGE结果见图2, mAb 2F5的IMAC柱层析纯化结果见图3。
   
　　(3)GF层析柱纯化: 腹水mAb 2F5经上述IMAC层析法纯化后, 经SDSPAGE鉴定目的mAb的纯度仍不高（80%）, 故需用GF层析法再进行纯化。即取IMAC层析柱洗脱的活性组份, 加入到经缓冲液(pH7.2的20 mmol/L PBS)平衡的GF层析柱中并用该缓冲液洗脱, 收集洗脱峰, 经SDSPAGE鉴定, 两步串联层析后, mAb 2F5的纯度可达90%以上（图4）。mAb 2F5的IMAC柱层析纯化结果见图5。

　　图2  以不同洗脱条件进行IMAC柱层析纯化的mAb 2F5的SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白marker; 1, 3, 5: 以不同的pH梯度、 NH4Cl梯度及咪唑梯度洗脱的流出组分; 2, 4, 6: 以不同的pH梯度、 NH4Cl梯度及咪唑梯度洗脱的洗脱组分.

　　图3  由IMAC层析柱采用pH梯度洗脱纯化mAb 2F5的层析图（略）

　　Ⅰ: 流穿峰的组分; Ⅱ: mAb 2F5的洗脱峰.

　　图4  采用两步串联层析法纯化的mAb 2F5 SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白marker; 1: 从IMAC柱中洗脱的组分; 2: 从IMAC+GF柱中洗脱的组分.

　　图5  由IMAC+GF层析柱两步串联法纯化mAb 2F5的层析图（略）

　　Ⅰ: 目的蛋白的组分; Ⅱ: 盐小分子的洗脱峰.

　　2.2  mAb 2F5促进PBTC增殖的作用  3HTdR掺入法检测表明, 激发型mAb 2F5, 能有效地协同抗CD3 mAb激发PBTC的活化和增殖效应（图6）, 且其促增殖作用优于用实验室常规的Protein G亲和层法纯化的mAb 2F5。

　　图6  mAb 2F5在体外促进PBTC增殖的作用（3HTdR法）（略）

　　3  讨论

　　IMAC法已成为蛋白质分离纯化中所用最广泛的亲和层析方法之一。该法分离纯化蛋白质的原理主要是利用蛋白质表面的一些氨基酸, （如组氨酸、 色氨酸、 赖氨酸等Lewis碱）可与弱的水合固相化的过渡金属离子（Cu2+、 Zn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+）相结合, 结合能力的大小除与蛋白质表面暴露的氨基酸残基数量有关外, 还与结合位点的空间分布是否有利于与金属离子的结合有关。因而, 采用合适的上样及洗脱条件, 便可将目的蛋白与杂蛋白分离。该法具有交换载量大, 分离条件温和, 通用性强, 易于放大等特点, 特别是在纯化mAb的过程中, 由于洗脱条件的温和, 可较好地保持mAb的生物学活性, 因而越来越受到人们的重视。在IMAC法中, 由于蛋白质的氨基酸残基与金属离子的结合是一个动态平衡的过程, 因而, 不同的上样流速可影响蛋白质与IMAC层析柱的动态结合。在低流速条件下, 蛋白质可全部保留在IMAC层析柱的介质上, 有较高的动态载量; 而在高流速条件下, 则有目的蛋白穿过而使纯化的回收率降低。本研究中, 我们采用较低流速（≤0.3 mL/min）的条件上样, 获得了较高的纯化效率。根据价键理论, 蛋白质与金属的螯合是通过蛋白质表面氨基酸上的给原子（如N原子等）的孤对电子与金属离子上的空杂化轨道结合形成的[6]。由于H+也可提供空杂化轨道, 因此, 可与金属离子同时竞争蛋白质表面上的孤对电子, 即采用降低pH值进行梯度洗脱时, 目的蛋白质即可较容易地洗脱下来。而其他竞争性物质（如含有N原子等电子给予体的小分子物质咪唑、 NH4Cl等）, 由于可改变蛋白质与金属离子之间的亲和力, 也可将蛋白质洗脱下来。本实验探讨了pH梯度、 NH4Cl、 咪唑浓度梯度洗脱等对mAb纯化的影响。结果显示, 在上述3种条件下, mAb 2F5均可被洗脱下来, 而其中以pH梯度进行洗脱时, 目的mAb的回收率最高。因而, 在mAb的纯化中, 以采用pH梯度洗脱更为有效并为了保持洗脱mAb的生物学活性, 我们采用了pH8.0～4.0梯度进行洗脱。mAb 2F5经IMAC层析柱纯化后, 纯度可达80%, 再用GF层析法对其进行精细纯化后, 最终纯度达到90%。同时, 对用Protein G亲和层析一步法纯化mAb 2F5与上述两步串联方法纯化的mAb 2F5的生物学活性进行了比较, 结果表明采用两步串联法纯化的mAb的生物学活性优于Protein G亲和层析法纯化的mAb。本研究中建立的采用IMAC串联GF两步层析法从小鼠腹水中纯化mAb 2F5的方法, 具有制备条件温和, 抗体活性保持好及纯度高等特点, 为其进一步的应用提供了实验依据。

　　:

　　[1] Laura IS, Bierer BE. Tlymphocyte coactivator molecules[J]. Curr Opin Hematol, 2001, 8(1): 5-11.

　　[2] Dengler TJ, Szabo G, Sido B, et al. Prolonged allograft survival but no tolerance induction by modulating CD28 antibody JJ319 after high responder rat heart transplantation[J]. Transplantation,1999, 67(3): 392-398.

　　[3] 张建平, 朱  勇, 刘雪松, 等. 应用HiTrap Sepharose SP阳离子交换色谱纯化小鼠F6单克隆抗体[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 1999, 15(4): 320-321.

　　[4] Manzke O, Tesch H, Diehl V, et al. Singlestep purification of bispecific monoclonal antibodies for immunotherapeutic use by hydrophobic interaction chromatography[J]. J Immunol Methods, 1997, 208(1): 65-73.

　　[5] 舒晓宏, 李传刚, 张海涛, 等. 抗核糖酸酶抵制因子抗体的制备[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(5): 572-574.

　　[6] 孙旭东, 李红旗, 隋洪艳, 等. 金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究[J]. 生物工程学报, 2000, 16(4): 495-499.

　　[7] Moss JA, Coyle AR, Ahn JM, et al. Tandem IMACHPLC purification of a cocainebinding scFv antibody[J]. J Immunol Methods, 2003, 281(1-2): 143-148.

　　[8] 孙中文, 陶  然, 陆艳红, 等. 5株鼠抗人CD28单克隆抗体的研制及生物学特性的研究[J]. 免疫学杂志, 2005, 21(4): 25-29.

　　[9] 邱玉华, 张学光, 郭  玲, 等. 鼠抗人sIL6R单克隆抗体的制备及sIL6R检测方法的建立[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 1997, 13(4): 58-62.