双歧杆菌DNA对小鼠巨噬细胞中PKC和NF

                 作者：王立生 李迎雪 朱惠明, 朱忠生 马晓冬

【关键词】  双歧杆菌DNA;,巨噬细胞;,蛋白激酶C;,核因子

　　Influence of bifidobacterium DNA on PKC and NFκB in murine macrophages

　　[Abstract]  AIM: To explore the influence of DNA of bifidobacteriua adolescence on PKC and NKκB of murine macrophages. METHODS: The fluorescent intensity of PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε and PKCζ in murine peritoneal macrophages was detected by using laser confocal microscope. The density of NKκB+ macrophages was detected by immunocytochemical staining. RESULTS: The average fluorescent intensity of PKCα and PKCβII produced by mouse peritoneal macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P<0.01）. There was no statistically significant difference of average fluorescent intensity of PKCβI、 PKCγ、 PKCε and PKCζ between the two groups（P>0.05）. The density of NKκB+ macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P<0.01）. CONCLUSION: DNA of bifidobacteria adolescence could activate macrophages by promoting the activity of PKCα、 PKCβII and NFκB.

　　[Keywords]bifidobacterium DNA; macrophage; protein kinase C; nuclear factorκB

　　[摘 要]  目的: 探讨青春型双歧杆菌的DNA对巨噬细胞中6种PKC和NFκB的影响。方法: 通过激光共聚焦显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度, 以免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞中NFκB+细胞的密度。结果: 双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞中, PKCα和PKCβII的平均荧光强度明显高于对照组（P<0.01）; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的平均荧光强度在两组间则无统计学意义（P>0.05）。双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中, NFκB+细胞的密度显著高于对照组（P<0.01）。结论: 青春型双歧杆菌的DNA可通过活化PKCα、 PKCβII和NFκB来激活巨噬细胞。

　　[关键词]双歧杆菌DNA; 巨噬细胞; 蛋白激酶C; 核因子κB
   
　　双歧杆菌是人体和动物肠道内数量最多的生理性厌氧菌, 能调节肠道的微生态平衡, 也有抗肿瘤、 抗感染和免疫激活等多种重要的功能[1]。目前研究发现, 双歧杆菌的DNA中含有非甲基化的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序(cytidinephosphateguanosine, CpG DNA), 可作为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence)激活树突状细胞(DC), 上调其表面分子和共刺激分子(如CD69、 MHCI、 MHCII类分子、 CD80以及CD86等)的表达。同时, 其还能激活NK细胞和B细胞, 使之产生较多量的IFNγ和抗体[2]。此外,其亦可激活巨噬细胞, 增强其吞噬和细胞毒作用, 并分泌较多量的IL1及IL6, 但其具体的作用机制目前仍不清楚[3]。本研究中应用激光共聚焦显微镜和免疫细胞化学染色法, 检测了青春型双歧杆菌的DNA对小鼠腹腔巨噬细胞中PKC和NFκB的影响, 旨在探讨其激活巨噬细胞的信号途径。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  BALB/c小鼠, 6~8周龄, 雌雄各半, 体质量为18~23 g, 购于南方医科大学实验动物中心。兔抗鼠PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ, 购自New England Biolab公司。FITC标记的羊抗兔IgG、 兔抗p65抗体和生物素化的羊抗兔IgG, 均购自北京中山生物技术有限公司。溶菌酶和LPS为Sigma公司产品。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2  方法

　　1.2.1  菌种来源及其培养  双歧杆菌由本室从健康婴儿粪便中分离培养获得, 经API20A及TAB系统和多次生化反应鉴定为青春型。实验时, 将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中, 置厌氧培养箱, 于37℃培养72 h。将含菌培养液以3000 r/min离心10 min, 去上清, 沉渣以PBS液洗3次, 并调整细菌数为1×1013/L。

　　1.2.2  双歧杆菌DNA的制备和鉴定  将双歧杆菌接种于硫乙醇酸盐肉汤中, 置厌氧培养箱中于37℃培养72 h。收集细菌, 加入溶菌酶（1 g/L）与SDS（终浓度为10 g/L）裂解菌体后, 用饱和酚抽提去除菌体蛋白并透析。用紫外分光光度计测定所提取的双歧杆菌基因组DNA的A260/A280为1.976。测定DNA的浓度后, 经薄板层析证实,所制备的双歧杆菌DNA中无脂多糖存在, 冷冻干燥后备用[4]。

　　1.2.3  实验分组及双歧杆菌DNA的处理  实验动物分为两组, 即(1)双歧杆菌DNA注射组: 20只小鼠, 于实验的第1天向小鼠腹腔注射100 g/L硫乙醇酸盐肉汤2 mL, 第2天起腹腔注射双歧杆菌DNA 0.2 μg, 每天1次, 连续5 d。 (2)对照组: 动物的数量及第1天的处理措施均同双歧杆菌DNA注射组, 不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 mL, 每天1次, 连续5 d。

　　1.2.4  巨噬细胞的收集及培养  于实验的第7天, 常规消毒小鼠腹部的皮肤, 以冷的Hank’s液灌洗腹腔。洗出液以1000 r/min离心10 min, 去上清, 沉渣以无血清的RPMI1640培养液重悬2次, 并调整细胞数为1×109/L。吸取100 μL细胞悬液加至孔底铺有盖玻片的24孔细胞培养板中, 置37℃、 50 mL/L CO2 孵箱中培养2 h。弃去未贴壁的细胞, 即得巨噬细胞。再加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液及LPS(终浓度为10 μg/L), 500 μL/孔, 继续诱导培养24 h。

　　1.2.5  巨噬细胞PKC含量的检测  通过激光共聚焦显微镜观察PKC的荧光强度反映PKC的含量。具体操作步骤为: ①倾去培养孔内的培养液, 取出爬有巨噬细胞的盖玻片, 滴加3 mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性; ②以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ③滴加100 g/L非特异性牛血清白蛋白, 室温孵育10 min; ④以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min;  ⑤分别滴加兔抗鼠PKCα、 抗PKCβI、 抗PKCβII、 抗PKCγ、 抗PKCε和抗PKCζ抗体各100 μL, 工作浓度均为1∶200, 于37℃温育60 min; ⑥以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ⑦滴加1∶100 FITC标记的羊抗兔IgG100 μL, 于37℃温育30 min; ⑧以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗涤5次×5 min; ⑨用激光共聚焦显微镜逐个观察巨噬细胞中的荧光强度。所用激发波长为488 nm, 发射波长为475 nm, 每孔于不同视野计数100个细胞以上, 取其平均荧光值作为定量参数。

　　1.2.6  NFκB的免疫细胞化学染色  取出细胞培养板孔内爬有巨噬细胞的盖玻片, 以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次, 干燥。染色程序按免疫细胞化学SP法常规进行。一抗为兔抗p65抗体, 二抗为生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.7  观察指标及统计学处理  对每张盖玻片以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中细胞核着色的阳性细胞数, 每例计数10个网格, 取其均值作为该样本中NFκB+细胞的密度, 以t检验行统计学处理。其余各组间的比较也采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  巨噬细胞中6种PKC含量的检测  以激光共聚焦显微镜观测巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度。结果显示, 小鼠腹腔巨噬细胞被青春型双歧杆菌的DNA刺激后, 其PKCα和PKCβII的荧光强度明显高于对照组（P<0.01）; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε及PKCζ的荧光强度在两组间无统计学意义（P>0.05, 表1、 图1）。

　　表1  巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε及PKCζ含量的检测　略

　　图1  小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα表达的激光扫描共聚焦显微镜观测　略

　　2.2  双歧杆菌DNA对巨噬细胞中NFκB表达的影响  NFκB主要是由p50和p65组成的异源二聚体。实验用兔抗p65抗体作为免疫细胞化学染色中的一抗, 其结果即可反映NFκB的存在。实验结果中, NFκB阳性产物表现为黄褐色颗粒状物。双歧杆菌的DNA注射组巨噬细胞中, NFκB阳性产物存在于胞浆和胞核, 但以胞核为主, 其胞核上NFκB阳性产物的密度为（17563±1020）个; 对照组巨噬细胞中NFκB的阳性产物主要位于胞浆, 其胞核上NFκB阳性产物的密度为（8398±764）个, 两组比较差异具有统计学意义(P<001)。

　　3  讨论

　　PKC是结构相近、 依赖钙、 磷脂和二酰基甘油激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的多基因超家族,对细胞生长和转化的调节起重要作用。目前已阐明, 很多巨噬细胞的激活剂均能使其胞内PKC的浓度上升。Lin等[5]证实, UTP可激活小鼠RAW264.7巨噬细胞, 提高磷脂酶A2及花生四烯酸的水平依赖的磷酯酰胆碱磷脂酶 C（PIPLC）的活化以及胞内[Ca2+]i浓度的升高, 并证实 PKC的激活亦参与了这一过程。Kumar等[6]报道, 催乳素能激活小鼠腹腔巨噬细胞,使之分泌大量的IL1和NO, 其机制主要是激活PKC。Shishodia和Um等[7, 8]则分别报道, 顺铂和II 型肺炎链球菌细胞壁多糖能激活巨噬细胞, 产生多量的TNFα, 这一过程需要PKC的活化。本研究表明, 双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中PKCα和PKCβII的荧光强度明显高于对照组; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε及PKCζ的荧光强度在两组间无统计学意义, 提示青春型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞中的PKCα和PKCβII; 而对PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的活性无明显影响。静息状态下, NFκB的同源或异源二聚体与抑制性蛋白IκB结合而存在于胞质中。当细胞受到外界刺激时, 可通过信号转导激活IκB激酶（IKK）, 导致IκB发生磷酸并被降解, 于是NFκB释放出来并被激活, 接着发生核易位, 和靶基因的特定位点相结合, 从而调控靶基因的转录。已知NFκB的活化是巨噬细胞的激活机制之一。von Knethen等[9]发现, 亚致死量的H2O2 能活化小鼠 RAW264.7巨噬细胞中的NFκB, 进而增强环氧合酶 2 的表达。Darieva等[10]证实, BCG能激活小鼠J774巨噬细胞, 使之分泌多量的IL6、 NO 和TNFα等具有杀瘤活性的效应分子, 其机制主要是增强NFκB DNA的结合。Liu等[11]报道, 乳酸杆菌细胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan, PG）可作用于小鼠RAW264.7巨噬细胞的Tolllike 受体2(Tolllike receptor 2, TLR 2), 进而激活NFκB, 最终增强其细胞毒活性。Mandrika等[12]也发现, 具有抗炎和免疫调节作用的黑色素细胞刺激激素α(alphamelanocytestimulating hormone, αMSH)能促使巨噬细胞中的NFκB核转位, 进而上调诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达, 最终催化底物精氨酸产生多量的NO。李义军等[13]则证实, 细菌内毒素能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞NFκB的活性。本研究表明, 双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞细胞核表达NFκB+细胞的密度显著高于对照组, 提示青春型双歧杆菌的DNA能有效地促进巨噬细胞中NFκB的转位和活化。已知双歧杆菌的DNA能激活机体免疫系统中的巨噬细胞。宋文刚等[14]报道, 婴儿型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞, 增强其吞噬功能, 并使之分泌多量的IL1和TNFα。Stacey等[15]证实, 分叉双歧杆菌的DNA能刺激巨噬细胞释放多量的IL6和 IL12。目前认为, 细菌DNA激活巨噬细胞的途径主要为刺激性CpG DNA与巨噬细胞Toll 样受体9(Toll like receptor 9, TLR 9)的结合, 接着诱导细胞内产生多量的活性氧(ROS)。ROS作为第二信使, 进一步可活化MAPK和AP1等信号分子, 最终调节相关基因的表达[16]。结合本研究的结果, 我们认为, 活化PKCα、 PKCβII及 NFκB是青春型双歧杆菌DNA激活巨噬细胞的另一途径。

　　:

　　[1] 王立生, 朱惠明, 潘令嘉, 等. 双歧杆菌的脂磷壁酸对小鼠腹腔MΦ的活性作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2002, 18（1）: 23-24.

　　[2] Agren J, Thiemermann C, Foster SJ, et al. Cytokine responses to CpG DNA in human leukocytes[J]. Scand J Immunol, 2006, 64(1): 61-68.

　　[3] Li Y, Qu X, Tang H, et al. Bifidobacterial DNA induces murine macrophages activation in vitro[J]. Cell Mol Immunol, 2005, 2(6): 473-478.

　　[4] 宋文刚, 曲  迅, 张彬彬, 等. 双歧杆菌DNA对小鼠腹腔巨噬细胞分泌和杀瘤功能的影响[J]. 肿瘤学杂志,  2002, 8(2): 89-91.

　　[5] Lin WW, Chen BC. Pharmacological comparison of UTP and thapsigargininduced arachidonic acid release in mouse RAW 264.7 macrophages[J]. Br J Pharmacol, 1998, 123(6): 1173-1181.

　　[6] Kumar A, Singh SM, Sodhi A. Effector of prolactin on nitric oxide and interleukin1 production of murine peritoneal macrophages:role of Ca2+ and protein kinase C[J]. Infect Immunol, 2001, 69(5): 2788-2796.

　　[7] Shishodia S, Shivastava A, Sodhi A. Protein kinase C: a potential pathway of macrophage activation with cisplatin[J]. Immunol Lett, 1998, 61(2-3): 179-186.

　　[8] Um SH, Rhee DK, Pyo S. Involvement of protein kinase C and tyrosin kinase in tumoricidal activation of macrophage induced by Streptococcus pneumoniae type II capsular polysaccharide[J]. Int Immunopharmacol, 2002, 2(1): 129-137.

　　[9] von Knethen A, Callsen D, Brune B. Superoxide attenuates macrophage apoptosis by NFkappaB and AP1 activation that promotes cyclooxygenase2 expression[J]. J Immunol,1999,163(5): 2858-2866.

　　[10] Darieva ZA, Lasunskaia EB, Kipnis TL, et al. Two BCG vaccine formulations prepared from the same strain with different J774 macrophage activation capacities and patterns of NFkappaB induction[J]. Int J Mol Med, 2000, 6(5): 575-580.

　　[11] Liu Y, Wang Y, Yamakuchi M, et al. Upregulation of tolllike receptor 2 gene expression in macrophage response to peptidoglycan and high concentration of lipopolysaccharide is involved in NFkappaB activation[J]. Infect Immun, 2001, 69(5): 2788-2796.

　　[12]Mandrika I, Muceniece R, Wikberg JE. Effects of melanocortin peptides on lipopolysaccharide/interferongammainduced NFkappaB DNA binding and nitric oxide production in macrophagelike RAW 264.7 cells:evidence for dual mechanisms of action[J]. Biochem Pharmacol, 2001, 61(5): 613-621.

　　[13] 李义军, 宗  城, 李天鹏, 等. 内毒素和地塞米松对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞中NFκB的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2002, 18(1): 13-15.

　　[14] 宋文刚, 曲  迅, 张彬彬, 等. 双歧杆菌DNA对小鼠腹腔巨噬细胞表面分子表达及分泌功能的影响[J]. 泰山医学院学报, 2002, 23（1）: 20-23.

　　[15] Stacey KJ, Sester DP, Sweet MJ, et al. Macrophage activation by immunostimulatory DNA[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2000, 247(1): 41-58.

　　[16] Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. A tolllike receptor recognizes bacterial DNA[J]. Nature, 2000, 408(6813): 740-745.