细胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定
作者：刘海英, 杨微, 武正华, 唐晓波, 朱大岭
【关键词】 CYP3A4;,合成肽;,多克隆抗体,
[摘 要] 目的: 制备兔抗人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）抗体及其特性鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列, 根据亲水性、 抗原性、 柔韧性及表面性等指标选择多肽序列, 合成CYP3A4多肽, 与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联, 免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体, 间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数, Western blot鉴定其特异性, 免疫组化进行定位。结果: 获得针对小分子CYP3A4的抗体。该抗体效价为1∶16000; 相对亲和力常数在105～106 M-1, 具有实用价值; 可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应; 可识别正常人肝脏组织CYP3A4; Western blot的结果显示, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为46000。结论: 合成的多肽KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、 Western blot和免疫组化实验。
[关键词]CYP3A4; 合成肽; 多克隆抗体
细胞色素3A4(CYP3A4)是细胞色素P450 超家族成员之一, 主要存在于肝脏中、 小肠中。它是人类药物代谢酶中的最重要的酶, 在临床上超过半数的药物完全或部分地被该酶代谢[1]。CYP3A4与外源性致癌物、 抗癌药物和内源性类固醇激素、 维生素、 脂肪酸的代谢转化密切相关[2, 3]。目前, 国外已研制出抗CYP3A4的抗体并且应用试验中; 而国内在研制CYP450抗体领域属于空白阶段, 我们研制出针对278-292 位的抗人CYP3A4抗体, 并将对CYP3A4功能的研究、 体外药物代谢及对其基因表达调控的肿瘤防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料 日本大耳白兔, 雄性, 6周龄, 由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）均购自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购自Jackson ImmunoResearch公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。
1.2 方法
1.2.1 CYP3A4抗原表位的分析 由SWISS PROT网站获知CYP3A4蛋白的序列, 然后利用DNAStar软件分析其序列的特点, 确定278-292位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列: SQNSKETESHKALSD。
1.2.2 CYP3A4多肽的合成及其与KLH和BSA的交联 CYP3A4多肽由北京中科亚光生物有限公司合成; 获得的多肽经常规C18的RP2HPLC柱进行纯化, 纯度达95%。CYP3A4与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法, 将5 mg合成多肽分别加入7 mg KLH和BSA中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L的戊二醛溶液（1 mL）, 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜, 交联成CYP3A4KLH、 CYP3A4BSA偶联物。
1.2.3 兔抗CYP3A4多肽抗体的制备 每只取200 μg多肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射, 每点约100 μg。2 周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射; 以后隔2周加强1次; 从第3次加强免疫开始, 每次免疫后7 d, 经耳缘静脉采血测定抗体的效价[4, 5]。经4次加强免疫后, 符合要求, 立即颈动脉取血。分离血清后, 无菌分装保存于-80℃备用。
1.2.4 人肝脏微粒体蛋白制备 取10 g正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4℃以10000 g离心30 min, 取上清液, 以30000 g 离心60 min, 取上清液及100000 g离心60 min, 取沉淀后, 悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200 mL/L甘油, 5 g/L胆酸钠, 2 mg/L抑肽酶, 2 mg/L亮肽素, 1 mg/L胃酶抑素及1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中, 用Bradford法进行蛋白定量。分装后, 置于-80℃冰箱内贮存备用。
1.2.5 抗血清的纯化 用醋酸钠缓冲液（60 mmol/L, pH=4.0）将抗血清稀释3～4倍, 0.1 mol/L NaOH调节pH至4.5, 缓慢滴加辛酸至浓度为25 mL/L, 室温搅拌30 min。4℃ 10000 g离心30 min, 弃沉淀后滤膜（0.22 μm）过滤, 加入1/10体积的10×PBS, 用0.1 mol/L NaOH调节pH至7.4, 缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45%饱和度, 混合后4℃过夜。4℃ 3000 g离心30 min, 弃上清后, 用0.01 mol/L PBS（pH=7.4）重悬, 透析过夜。用Branford法进行蛋白定量。经SDSPAGE分离后, 用BIORAD quantity one软件分析其纯度。
1.2.6 ELISA检测抗血清效价 ELISA检测板用以多肽BSA偶联物以1 mg/L的浓度包被, 每孔100 μL, 4℃孵育过夜后, 用10 mL/L的牛血清封闭, 每孔200 μL, 37℃ 2 h后, 洗涤备用。取出包被好的检测板, 每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100 μL (对照为正常兔血清) , 37℃孵育30 min, 洗涤3次后每孔加入1 ∶5000 稀释的HRP 标记的羊抗兔IgG 100 μL, 37℃孵育15 min, 洗涤3次后进行TMB显色, 37℃孵育15 min, 终止反应后, 用酶标仪式测定样品A450值.
1.2.7 间接 ELISA检测抗血清亲和常数 ELISA检测板分别用多肽交联BSA包被成5 mg/L 和10 mg/L, 封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的多抗, 再加入HRP 标记的羊抗兔IgG二抗, TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标, A值为纵坐标作图。以曲线达到水平的A值为100%, 求出A50 即50%A值时对应的抗体浓度.按照Kaf f=(n－1)/2(n[Ab’] t－2[Ab]t)算出抗体亲和常数, 其中[Ab’]t 、 [Ab]t指的是A50时即包被分别5 mg/L和10 mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度, [Ag]t, [Ag’]t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10 μg和5 μg, n=[Ag]t/Ag’]t, 本实验中n=2[6]。
1.2.8 多克隆抗体的Western blot分析 用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽BSA及BSA, 于95℃加热5 min, 置于冰上冷却10 min。上样量分别为70、 15和15 μg, 经SDSPAGE分离后, 以湿转法电转至硝酸纤维素膜上。经脱脂奶粉封闭（室温1 h）后, 依次滴加1∶1000稀释抗血清（4℃过夜, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次）及1∶10000 HRP山羊抗兔IgG（室温孵育1 h, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次）。用化学发光剂试剂盒（ECL Plus）处理5 min后, 于暗室曝光到X胶片上显影、 定影。
1.2.9 多克隆抗体的免疫组化染色 取出用丙酮固定的冰冻人正常肝脏组织切片, 滴加50 g/L BSA, 室温下封闭20 min, 加入1∶1000稀释兔抗人CYP3A4多肽抗体, 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgGHRP, 37℃孵育20 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后, 脱水、 透明、 封片, 镜检, 放大400倍拍照记录结果[7]。
2 结果
2.1 CYP3A4的氨基酸序列分析 用DNAStar软件对蛋白序列进行分析（图1）, 根据亲水性、 抗原性、 表面性及柔韧性4个参数预测的结果进行综合考虑, 选取欲合成的多肽序列为278-292位氨基酸（图中阴影区）: SQNSKETESHKALSD。
图1 DNAstar软件对人CYP3A4蛋白序列参数的预测 略
2.2 CYP3A4合成肽抗原的合成与纯化 化学合成的多肽经HPLC纯化后, 纯度可达95%, 交联KLH后可作为抗原免疫动物。
2.3 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 间接ELISA法检测表明, 抗血清的效价为1∶16000。②相对亲和力常数测定: 纯化抗血清按1∶2的蛋白浓度倍比稀释, 绘制标准曲线如图2所示, 结果表明相对亲和力常数在105～106 M-1。③抗体特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽BSA、 BSA作为抗原, 以兔抗血清作为一抗进行Western blot分析显示, 抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为46000处出现1条清晰带, 与CYP3A4 Mr相符; 与多肽BSA在Mr约为69000处出现1条清晰带, 与BSA Mr相符; 而与BSA则无条带出现（图3）。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP3A4蛋白结合。
图2－图3 略
2.4 兔抗人CYP3A4多克隆抗体的免疫组化定位 CYP3A4主要分布在内质网和线粒体内膜, 而二者位于胞质中。经免疫组化实验证明, CYP3A4多肽多克隆抗体可与正常人肝细胞胞质中的CYP3A4蛋白结合（图4）。
图4 兔抗人CYP3A4多克隆抗体的免疫组化定位分析 略
3 讨论
国外Abcam、 Researchd、 Cypex公司已研制出用于ELISA、 Western blot和免疫组化的抗CYP3A4抗体, 但上述公司抗体仅能应用部分试验。而本实验室的抗CYP3A4抗体可完全用于以上试验。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团, 找到一个抗原的表位, 就可能研制出针对该抗原的抗体或疫苗。结合生物信息学,用多参数的综合预测抗原表位可以提高预测的准确性[8]。本实验中进行蛋白质序列表位分析时, 着重考虑了以下几个方面[9]: ①亲水性高。疏水性片段往往为跨膜成分或嵌入膜成分; 而亲水性片段多暴露在脂质双分子膜外, 容易形成抗原识别位点。②表面可及性强。③柔韧性好, 更易形成三维结构, 暴露抗原表位。④连续性表位的氨基酸残基数在10～20之间为宜, 过短时不易形成明显的表位, 过长则合成时发生错误的机会增加。根据以上原因最终确定以亲水性强、 抗原指数高、 表面性及柔韧性好的区域（即278-292位14个氨基酸）作为CYP3A4的抗原决定簇。虽然合成肽与载体蛋白（KLH）偶联可增加免疫原性, 但也会产生一定的抗KLH的抗体[10]。所以, 在间接ELISA法中包被抗原用多肽BSA而不是多肽KLH, 以避免KLH的干扰。同样原因, 在Western blot实验中, 用多肽BSA和BSA各作抗原, 以避免KLH的干扰。本实验中获得的抗血清与人肝微粒体蛋白的免疫印迹分析结果显示2条特异性条带, 一条Mr是46000, 另一条大约是90000。我们认为90000的条带可能是CYP3A4的二聚体。抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。多克隆血清是含有不同亲和力抗体的复杂混合物, 因此, 多克隆血清的亲和力不能精确测定下来, 但可制定其平均相对亲和力[11]。根据, 本实验中相对亲和力在105～106 M-1, 对确定抗体的用途和验证抗体的均一性等均有重要价值。总之, 我们以合成肽KLH为抗原免疫家兔制备了抗CYP3A4 pAb,Western blot 分析pAb 的特异性良好、 效价高, 为后续CYP3A4分子功能的研究和与药物代谢的研制及应用提供了有用的工具。
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