外源性人aFGF在内皮祖细胞中的分泌
作者：颜雪芸, 王飞, 周卿, 荣烨之, 陈书艳
【关键词】 酸性成纤维细胞生长因子;,信号肽;,转基因
[摘 要] 目的: 观察外源重组分泌型人酸性成纤维细胞生长因子（spaFGF）在内皮祖细胞（EPC）中的分泌。方法: 以腺相关病毒为载体, 将spaFGF基因和绿色荧光蛋白基因（GFP）分别导入内皮祖细胞中。收集转基因EPC和未转基因EPC培养液, 用ELISA方法检测其中的aFGF蛋白, 并比较3组细胞分泌的aFGF的量。结果: 在感染细胞的第4天, 转基因EPC出现绿色荧光。spaFGFEPC组分泌的aFGF量显著高于GFPEPC和EPC组[（862±49） ng/L vs （115±16） ng/L, P<005; （862±49） ng/L vs （98±10） ng/L, P<005）]。结论: 在EPC中导入外源性spaFGF基因能增强人aFGF的分泌。
[关键词] 酸性成纤维细胞生长因子; 信号肽; 转基因
通过基因修饰的方法促进性血管新生是近年来心血管领域的一个新的研究热点, 代表着一种克服缺血组织再灌注障碍和促进侧枝的新方向[1]。酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor, aFGF, FGF1）是FGF家族的重要成员, 在血管形成过程中有重要作用[2], 可以通过促进受损内皮细胞修复等机制, 促进血管再生。由于原始aFGF缺乏信号肽, 不能由完整细胞分泌, 故直接用aFGF进行基因转染, 治疗效果不理想。本实验中, 我们将一个带有信号肽序列的重组人aFGF基因（spaFGF）克隆到AAV载体中, 以病毒转染细胞的方式, 将spaFGF基因导入EPC中。通过基因表达, aFGF得以由EPC分泌, 为下一步研究转基因细胞移植促进缺血组织的血管新生奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 spaFGFpAAVIREShrGFP质粒为本实验室构建; pAAVIREShrGFP质粒、 pAAVRC质粒和pHelper质粒购自Stratagene公司; AAV293细胞, AAVHT1080细胞由发育生物学实验室惠赠; EPC为本实验室自备; 高糖DMEM培养液和胰蛋白酶EDTA购自Gibco公司; aFGF ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。
1.2 方法
1.2.1 构建含外源基因的重组AAV 我们先前已构建含信号序列的分泌型人aFGF基因[3], 并将此重组基因插入到AAV载体质粒pAAVIREShrGFP上。携带spaFGF的重组pAAVIREShGrFP质粒与pHelper质粒、 pAAVRC质粒共转染AAV293细胞后, 可包装出编码spaFGF基因的重组病毒spaFGFAAV; 用同样的方法包装出编码绿色荧光蛋白的重组病毒GFPAAV。
1.2.2 AAV感染HT1080细胞 将AAVHT1080细胞以3×105/孔的密度接种在6孔板中, 每孔加入2 mL含100 mL/L FCS的DMEM培养液, 37℃、 50 mL/L CO2, 培养24 h。吸出6孔板中培养液, 按1 mL/孔将倍比稀释的病毒液加到6孔板中, 细胞在37℃培养1 h后, 每孔加入1 mL含100 mL/L FCS的DMEM。继续培养。
1.2.3 AAV感染内皮祖细胞 将EPC分成3组, 按1×105个/孔接种到6孔板中。分别用AAVspaFGF和AAVhrGFP感染EPC, 未感染的EPC作为对照, 标记为spaFGFEPC、 hrGFPEPC、 EPC。培养液为含50 mL/L胎牛血清的EGM2, 在37℃、 50 mL/L CO2中培养24 h。用PBS液洗涤细胞3次, 彻底洗去血清成分。在试管中将200 μL AAV浓缩液与1 mL无血清的EBM2混合, 加入到每孔细胞中。分别标记为“EPCspaFGF”, “EPChrGFP”和“EPC”。将细胞置于37℃、 50 mL/L CO2中培养2 h, 期间每隔15 min转动1次培养板, 保证病毒液与细胞充分接触。2 h后用1 mL含50 mL/L胎牛血清的EGM2代替无血清的EBM2, 置于细胞培养箱中继续培养。
1.2.4 检测细胞分泌的aFGF蛋白 收集spaFGFEPC、 hrGFPEPC、 EPC 3组细胞培养液, 离心后, 取上清液, 用ELISA试剂盒检测其中的人aFGF蛋白。取样品与倍比稀释的标准品各01 mL加入已包被抗人aFGF抗体的酶标板中, 一孔加样品稀释液作为0孔, 加盖。37℃反应120 min。反应后甩去酶标板内液体, 按01 mL/孔加入生物素抗人FGF acidic抗体工作液, 37℃反应60 min。01 mol/L PBS洗涤后, 加入ABC工作液（TMB空白显色孔除外）, 37℃反应30 min。洗涤后加入TMB显色液, 37℃避光反应。30 min后加入TMB终止液测定A450值。
1.2.5 统计学分析 用SPSS12.0软件包分析所得数据, 比较3组细胞分泌的aFGF, P<005为具有统计学意义。
2 结果
2.1 AAV感染HT1080细胞 将AAV感染AAVHT1080细胞, 48 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到细胞发出绿色荧光（图1）。流式细胞术分析显示, GFP+细胞数约占40%。图1 AAV感染AAVHT1080细胞（48 h后）
2.2 AAV感染内皮祖细胞 由于AAV载体质粒pAAVIREShrGFP中含有编码绿色荧光蛋白（hrGFP）的基因序列, 通过基因克隆的方法, 将spaFGF基因插入到GFP基因的上游, 通过荧光显微镜可实时观察AAV的感染情况。用同样滴度的AAVspaFGF和AAVGFP分别感染EPC, 在感染细胞的第4天时, 转导spaFGF基因的EPC和转导GFP基因的EPC均出现绿色荧光（图2）。
图2 AAV感染的EPC（略）
2.3 检测3组EPC分泌的人aFGF蛋白 转spaFGF基因的EPC分泌的aFGF水平显著高于转GFP基因EPC和未转基因EPC[（862±49） ng/L vs （115±16） ng/L, （862±49） ng/L vs （98±10） ng/L, P<005, 而后两组细胞分泌的aFGF差异无统计学意义[（115±16） ng/L vs （98±10） ng/L, P>005]。
3 讨论
当原先的血管不能提供充足的血流时, 侧支循环成为一个重要的血液供给的来源, 因此, 研究促血管生长成为缺血性心脏病的一个新方向。从动物模型到临床试验,对于应用细胞生长因子治疗组织缺血性疾病的研究早已开展[4-6], 实验证实, 在缺血心肌局部注射生长因子能促进侧支循环的[7]。aFGF是一种有效的促内皮细胞有丝分裂剂, 可以通过促进内皮细胞的激活、 迁移、 增殖和血管周细胞的募集的机制促进血管生长。aFGF半衰期短, 注射到体内很快被清除和降解, 而基因转导可以在较长一段时期内, 在组织局部维持适当浓度的生长因子水平, 达到治疗效果。由于人aFGF缺少信号肽序列, 不能以可溶性方式释放到细胞外, 因此, 在临床试验中要求对aFGF基因进行修饰, 即在aFGF基因的前端加上一段编码信号肽的基因序列, 构成分泌型aFGF基因。重组基因表达出带有信号肽的aFGF蛋白, 可分泌到细胞外, 从而增强其促血管新生作用。本实验的AAV系统中, spaFGF基因被克隆在载体质粒pAAVIREShrGFP的多克隆位点中, 和hrGFP（人重组绿色荧光蛋白）基因由同一个转录子翻译, 所以hrGFP的表达可以被用作确定对目的细胞的感染效率和作为插入的目的基因的表达标志。重组AAV感染细胞后, 当我们在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光时, 提示目的基因已经导入细胞中。在用AAV感染细胞的过程中, 我们发现, 被同样数量的AAV感染后, 不同的细胞出现绿色荧光的时间不同: 293细胞被感染24 h后出现绿色荧光; HT1080被感染48 h后出现绿色荧光; 而在EPC中, 至少需要72 h才能出现绿色荧光。流式细胞术的检测结果反映, AAV对HT1080细胞的转导率高于EPC, 这说明对于不同的细胞, AAV的感染能力不同。在用AAV感染293和HT1080细胞时, 我们发现加入丁酸钠（浓度为10 mmol/L）, 能增强绿色荧光蛋白的表达, 这可能是因为丁酸钠通过提高组蛋白的乙酰化, 增强病毒转基因的表达。但是, 在将丁酸钠加入到EPC中时, EPC状态明显变差, 这提示丁酸钠可能对EPC有毒性作用, 故无法利用丁酸钠提高外源spaFGF基因在EPC中的表达。用ELISA法能从转基因的EPC细胞培养液中检测到aFGF蛋白, 本实验结果显示, 与转GFP基因的EPC和未转基因的EPC相比, 转spaFGF基因的EPC分泌的aFGF显著升高, 说明导入外源性的含有信号肽序列的目的基因可以增加aFGF的表达, 也进一步证实spaFGF基因转导EPC是成功的。重组的spaFGF基因导入细胞后, 能在细胞中转录、 翻译, 表达带有信号肽的aFGF蛋白, 这种重组蛋白可沿经典分泌途径分泌到细胞外的培养液中。基因与细胞治疗心肌和外周组织缺血的研究早已开展[8], 我们选择EPC和aFGF作为研究对象是因为他们都具有促血管生长作用。冠状动脉疾病的患者体内EPC的数目和促血管生成能力被减弱, 这限制了EPC的治疗作用[9]。联合基因转导的细胞治疗也许可以弥补EPC数目有限所带来的应用缺憾。将重组aFGF循环基因导入EPC, 为我们下一步观察生长因子与细胞结合促血管生长效应奠定了基础。
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