抗大豆Ⅱ号亚型钙调素单克隆抗体的制备与鉴定

                      作者：王红 吴萌 赵宝华  赵亚朴

【关键词】  大豆;,钙调素;,亚型;,单克隆抗体

　　[摘 要]  目的: 制备抗大豆Ⅱ号亚型钙调素(SCaM2)单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法: 从含有pSCaM2的大肠杆菌BL21中, 提取并纯化SCaM2。以其作为抗原免疫BALB/c小鼠后, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合、 筛选及克隆化, 建立稳定分泌SCaM2 mAb的杂交瘤细胞株, 并对抗SCaM2 mAb进行鉴定。结果: 经两次细胞融合, 共获得10株可稳定分泌抗SCaM2 mAb的杂交瘤细胞株。对其中3株杂交瘤细胞制备的腹水mAb（6F11F3、 7C5E9、 7E10E2）, 用间接ELISA及免疫印迹实验表明, 在高稀释度时, mAb 6F11F3可识别SCaM1和SCaM2, 而mAb 7C5E9和7E10E2可分别识别SCaM4和SCaM5。Ig亚类鉴定结果表明, mAb 6F11F3和7C5E9均为IgG2a, mAb 7E10E2为IgG1。相加实验的结果显示, mAb 6F11F3和7C5E9可能识别SCaM2相同的抗原表位; 而mAb 7E10E2可能识别不同的抗原表位。mAb 6F11F3对SCaM2的亲和常数为（2.127±0.418）×106M-1, mAb 7C5E9对SCaM4的亲和常数为（9.69±2.406）×106M-1, mAb 7E10E2对SCaM5的亲和常数为（1.203±0.429）×107M-1。结论: 制备了可识别不同SCaM亚型的mAb 6F11F3、 7C5E9及7E10E2, 为研究SCaM的特性及功能提供了重要的制剂。

　　[关键词]大豆; 钙调素; 亚型; 单克隆抗体
   
　　植物钙调素(CaM)有多种亚型, 它们在生化特性、 组织分布及生物学功能等方面具有各自的特性。通过对不同亚型CaM进行亚细胞定位, 可了解各个亚型CaM的意义, 并在此基础上研究不同亚型CaM在植物生长发育过程中的作用及调节机制。我们制备了抗大豆2号亚型CaM（SCaM2）的单克隆抗体(mAb)并对其特性进行了鉴定。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  质粒pSCaM2和大肠杆菌BL21（DE3）由河北师大细胞学实验室惠赠。BALB/c纯系小白鼠, 由河北医科大学实验动物中心提供。Sp2/0Ag14小鼠骨髓瘤细胞, 由河北省院生物所提供。牛血清白蛋白、 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG及HT、 HAT、 胎牛血清, 均购自华美生物工程公司。IPTG为InaIC公司产品。标准低分子量蛋白、 Phenylsepharose 4B疏水亲和层析柱为Pharmacia公司产品。弗氏完全佐剂、 不完全弗氏佐剂、 TMB、 DMEM培养基、 IgG亚类检测试剂盒为Sigma公司产品。其他试剂为进口分装或国产分析纯试剂。

　　1.2  方法

　　1.2.1  SCaM2的提取与纯化  参照[1]的方法, 提取并纯化SCaM2。将含有pSCaM2质粒的大肠杆菌BL21进行培养, 在IPTG诱导下表达SCaM2蛋白。将表达的SCaM2通过PhenylSepharose 4B疏水亲和层析柱纯化后, 以SDSPAGE进行鉴定。

　　1.2.2  动物免疫及杂交瘤细胞株的建立  将纯化的SCaM2加完全福氏佐剂经颈背部皮下注射免疫BALB/c纯系小鼠, 20 μg/只。间隔3周, 以相同的途径注入用不完全福氏佐剂乳化的SCaM2抗原（用量同前）免疫, 共2次。选择抗体效价高的小鼠, 于细胞融合前3 d, 再以等量抗原的PBS溶液腹腔注射加强免疫1次。细胞融合、 筛选、 克隆化及腹水制备, 均按实验室常规方法进行。

　　1.2.3  mAb一般特性的鉴定  (1)Ig亚类鉴定: 采用经典的免疫双扩散法进行。中央孔分别加入20 μL辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA抗血清标准品, 周围孔依次加入各种抗SCaM的mAb腹水, 以骨髓瘤细胞的培养上清液作为对照, 置湿盒中于4℃下扩散48 h, 观察结果。(2)mAb的效价测定: mAb腹水经辛酸硫酸胺沉淀法[2]纯化后, 用间接ELISA法测定其效价。(3)特异性鉴定: ①ELISA鉴定: 以各亚型SCaM分别包被酶标板, 用间接ELISA检测腹水mAb与不同亚型SCaM的反应性, 结果以A450值表示。②Western blot分析: 将不同亚型的SCaM经SDSPAGE分离后, 电转移到0.33 μm的硝酸纤维素膜上。滴加含有30 g/L BSA的PBST封闭过夜后, 依次滴加纯化的腹水mAb及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（每次用洗涤液振荡洗涤5次, 每次10 min）。滴加TMB显色后, 于波长450 nm读取A值。

　　1.2.4  mAb亲和力常数的测定  采用非竞争ELISA法测定[8]。以不同浓度的3种SCaM亚型（分别为： 5、 2.5、 1.25 mg/L）包被酶标板, 封闭后, 依次加入倍比稀释的3株mAb及辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG, 加TMB显色后, 于波长450 nm测定A值。以每一株mAb浓度的对数值为横座标, 以其相应的A值为纵座标, 分别绘出包被不同浓度的各亚型SCaM的3条反应曲线。以各曲线上部趋于平坦的A值作为100%, 取50%点对应的mAb的浓度, 再按Beatty等[12]推导的公式Kaff=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab] t), 取3个Kaff的平均值即为亲和常数, 以Ka表示。

　　1.2.5  mAb识别的抗原表位分析  采用间接ELISA相加实验进行测定[5]。先用间接ELISA法测定纯化的mAb与包被抗原反应的饱和浓度。以SCaM2为抗原包被酶标板, 前两孔分别加入两种mAb, 其A值分别记录为A1和A2, 第3孔先以其中1种饱和量的mAb于室温作用2 h, 洗涤后再与另一种mAb作用2 h。洗涤后, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG, 于37℃保温2 h, 洗涤后加TMB显色,   A450值记录为A1+2, 相加指数AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100%。每组重复试验3次, 取其平均值。AI>50%者, 即认为2株mAb识别不同的抗原表位。

　　2  结果

　　2.1  杂交瘤细胞系的建立  取纯化的SCaM2免疫BALB/c小鼠, 经两次细胞融合, 反复筛选及再克隆化共获得10株可稳定分泌抗SCaM2的mAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清液的特异性, 10株杂交瘤细胞培养上清液均可与SCaM1、 SCaM2、 SCaM4及SCaM5出现反应, 其中3株（6F11F3、 7C5E9、 7E10E2）的A值与其他各株相比较差异较明显, 并且效价也较高。因此, 对此3株杂交瘤细胞进行了鉴定。

　　2.2  mAb一般特性的鉴定  (1)Ig亚类鉴定: mAb 6F11F3和7C5E9属于IgG2a, mAb 7E10E2属于IgG1。(2)效价测定: 3株mAb 6F11F3、 7C5E9、 7E10E2的腹水效价, 分别为10-5、 10-4、 10-4。(3)特异性鉴定: ①ELISA法的结果表明, mAb 6F11F3稀释到1∶32000时, 仅与SCaM1、 SCaM2出现反应; mAb 7C5E9、 7E10E2分别稀释到1∶64000和1∶32000时, 分别与SCaM4、 SCaM5出现反应。②Western  blot鉴定表明, mAb的浓度为1∶500时, mAb 6F11F3与SCaM1、 SCaM2出现条带, 差异不显著; mAb 7C5E9、 7E10E2与SCaM4、 SCaM5均出现两条带, 但mAb 7C5E9与SCaM4反应出现的条带更深; 而mAb 7E10E2与SCaM5反应出现的条带更深。而再将mAb的浓度稀释为1∶1000时, mAb 7C5E9与SCaM4出现的条带几乎不可见, mAb 7E10E2与SCaM5出现的条带颜色变浅。

　　2.3  mAb亲和力常数的测定  非竞争ELISA测定亲和力常数的结果(图1、 2、 3)。经计算mAb 6F11F3对SCaM2的亲和常数为（2.127±0.418）×106M-1; mAb 7C5E9对SCaM4的亲和常数为(9.69±2.406)×106M-1; mAb 7E10E2对SCaM5的亲和常数为（1.203±0.403）×107M-1。

　　图1 －图3  　略

　　2.4  mAb抗原表位的分析  ELISA相加实验的结果(表1)表明, mAb 6F11F3与7C5E9的相加指数为30.8%, 提示二者可能识别与SCaM2相同的抗原表位; mAb 7E10E2与6F11F3的相加指数为66.3%, 与7C5E9的相加指数为56.8%, 提示mAb 7E10E2可能与mAb 6F11F3和7C5E9识别与SCaM2不同的抗原表位。

　　表1  mAb对SCaM2的交叉反应（略）

　　3  讨论

　　由于mAb是针对某一表位抗原决定簇的, 不同亚型的SCaM差别很小, 尤其是SCaM1与SCaM2之间, 只有两个氨基酸的差别, 要制备各自特异性抗体的首要前提是要得到高纯度的抗原, 否则其他蛋白刺激产生的相应抗体, 会影响特异抗体的检测并增加筛选的工作量。为此, 选用了pET28b(+)表达载体来表达天然蛋白, 并根据CaM对Ca2+的结合特性, 选用PhenylSephrose 4B疏水亲和层析柱提取SCaM2, 以供mAb的制备和鉴定。SCaM是一种比较弱的免疫原, 因此, 采用3次颈背部皮下注射的方法免疫小鼠, 并在融合前3 d最后再加强免疫1次。ELISA试验的结果显示, 在高稀释度时, mAb 6F11F3仅识别SCaM1、 SCaM2; 而mAb 7C5E9、 7E10E2仅分别与SCaM4、 SCaM5出现特异性反应。Western blot也证实, mAb的特异性并不是绝对的, 某些mAb与其他抗原甚至不相关的抗原也可出现交叉反应。各亚型SCaM之间氨基酸序列的差别非常小, 如SCaM1与SCaM2之间只有2个氨基酸的差别, 乔红等[6]通过对SCaM各亚型抗原表位的多参数分析, 发现SCaM1与SCaM2的表位肽段中只有1个氨基酸的差别, 但由于此差异氨基酸不在其最佳的抗原表位, 便有可能引起交叉反应。另外, 乔红等还发现, 在SCaM1、 SCaM4、 SCaM5之间的最佳表位序列中各有两个氨基酸的不同, 但其三级或四级结构的构型有可能将其最佳表位遮盖, 或在抗原提取过程中其空间构象发生了变化, 使SCaM2的特异抗原表位被遮盖, 而SCaM4、 SCaM5的最佳表位则突显出来, 从而使小鼠产生针对SCaM4、 SCaM5特异性较高的抗体, 即出现上述免疫交叉反应。抗体的亲和力是依据抗体互补决定区与抗原决定簇之间分子空间构型的吻合程度而决定。抗体亲和常数是对抗原和抗体间作用最本质的描述, 是确定抗体性质的重要参数, 也是杂交瘤所分泌的mAb稳定性的重要指征。我们采用非竞争酶免疫法测定了mAb的亲和常数, 该方法不受抗原分子量的限制, 操作简便易行、 结果可靠。Beatty[9]及Loomans[10]的资料表明, 控制抗原包被的浓度是用非竞争ELISA法测定抗体亲和常数的重要因素, 而以较低浓度的包被抗原效果更佳。为此, 我们选取5、 2.5、 1.25 mg/L3个抗原浓度包被。从1∶100开始2倍系列稀释mAb检测A值, 最终测得mAb 6F11F3、 7C5E9和7E10E2相对亲和常数分别为: (2.127±0.418)×106M-1、 (9.69±2.406)×106M-1及(1.203±0.403)×107M-1。mAb识别表位的分析显示, mAb 7C5E9与6F11F3可能识别与SCaM2相同的抗原表位, mAb 7E10E2与7C5E9、 6F11F3可能识别与SCaM2不相同的抗原决定簇, 其原因可能是mAb 7C5E9、 6F11F3属IgG2a, 7E10E2属于IgG1, 因此, 3株mAb的互补决定区与抗原决定簇之间在空间结构吻合程度上有差异。由于SCaM1与SCaM2之间只有两个氨基酸的差异, 为mAb的制备带来很大困难。本研究虽然没有获得预期的抗SCaM2的特异性mAb, 但是获得可同时识别SCaM1和SCaM2的mAb 6F11F3, 只识别SCaM4的mAb 7C5E9, 以及只识别SCaM5的mAb 7E10E2。这些mAb的获得, 为不同亚型钙调素的亚细胞定位以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。

　　:

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