琼玉膏抑制肝癌细胞HBxAg表达及对原发性肝癌的防治作用

            作者：陈孝银  魏春山, 童光东 毛慧君, 夏芳, 江振友

【关键词】  肝癌;,琼玉膏;,HBxAg

　　Preventive and therapeutic effects of qiongyugao on hepatocellular carcinoma via inhibitionoftheexpressionofHBxAg in hepatic carcinoma cells

　　[Abstract]  AIM: To investigate the effects of qiongyugao on the expression of hepatitis B x antigen (HBxAg) in BALB/cnu mice into which human hepatic carcinoma cells were transplanted, and to analyze its specific mechanism in prophylaxis and treatment of hepatocellular carcinoma. METHODS: A nude mouse model with the transplantation of human hepatic carcinoma cells was established to observe the preventive and therapeutic effects of qiongyugao on the body weight and tumor weight of the mice. The expression of HBxAg in tumor and liver tissue wsa detected by immunohistochemical studies. RESULTS: Compared with model control group, prophylaxis and treatment with qiongyugao increased the body weight, depressed the tumor weight and inhibited HBxAg expression. The same efficacy was showed in both qiongyugao prophylaxis group and cyclophosphamide treatment group. CONCLUSION: Qiongyugao canslowdownthegrowthoftumorandinhibitthe expression of HBxAg, which may be an essential mechanism in prophylaxis and treatment of hepatocellular carcinoma.

　　[Keywords]hepatocellular carcinoma; qiongyugao; HBxAg

　　[摘 要]  目的: 观察琼玉膏对人肝癌细胞移植裸鼠HBxAg表达的影响, 分析其通过影响HBxAg表达防治原发性肝癌的机制。方法: 建立人肝癌细胞移植裸鼠模型,  观察琼玉膏预防及对小鼠体质量、 癌组织质量的影响, 同时采用免疫组化法测定癌组织及肝脏中HBxAg的表达。结果: 与模型组相比, 琼玉膏预防及治疗后, 裸鼠的体质量增长迅速, 癌组织质量偏低, 癌组织及肝脏HBxAg低表达。琼玉膏预防与环磷酰胺治疗的效果相近。结论: 琼玉膏能减缓肿瘤的生长, 并抑制HBxAg的表达, 后者可能是其防治原发性肝癌的主要机制之一。

　　[关键词]肝癌; 琼玉膏; HBxAg
   
　　原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 其5年生存率仅为5%, 死亡率为2037/100000, 占恶性肿瘤死亡率的第2位[1]。目前, 原发性肝癌的病因和发病机制虽未完全肯定, 但已有调查显示, 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是原发性肝癌发生的重要相关因素[2], 乙肝病毒的X基因是乙肝致癌过程中最主要的触发因子[3]。X基因位于HBV基因组不完全的双链DNA中负链上4个开放读码框（open reading frame, ORF）之一X区, 编码X蛋白, 即HBxAg。HBxAg是一反式激活因子, 在肝癌组织中高度表达, 可与TATA结合蛋白(TATA binding protein, TBP)作用, 激活病毒和细胞的启动子, 通过抑制DNA的修复, 干扰Fas/CD95系统和抑制Caspase3活性推进HBV感染所致肝癌的发生和[4]。琼玉膏（qiongyugao, QYG）是集治疗与保健于一体的古代良方, 我们的前期研究发现琼玉膏的主要成分有很好的抗乙肝病毒和肝纤维化的作用, 并对抑癌基因P21、 P53等的表达有一定促进作用, 但是其是否对乙肝后肝癌及肝癌癌前病变有治疗或预防作用却尚未明确。因此, 我们建立了人肝癌细胞裸鼠移植模型, 并监测琼玉膏预防及治疗后裸鼠体质量、 癌肿质量、 HBx的表达及肝癌病理改变。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  兔抗人HBxAg多克隆抗体血清由Thomas Jefferson University的Feitelson Mark 教授赠送; ABCkit购自Vector公司; 正常山羊血清, 生物素标记的羊抗兔抗体, 过氧化物酶标记的链酶卵白素、 多聚赖氨酸和二氨基联苯胺显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。环磷酰胺（cyclophosphamide, cytoxan, CTX）针剂由江苏恒瑞医药股份有限公司提供, 批号03121921。琼玉膏由本实验室自行配制, 方法如下: 取生地黄500 g、 茯苓100 g, 水提3次, 每次2 h, 合并滤液; 人参50 g先切成薄片, 水浸24 h, 继用文火水提2次, 每次2 h, 合并滤液, 倾入上述滤液, 静置; 取上清液, 水浴浓缩为相对密度121～125的原液1000 mL备用; 蜂蜜350 mL炼至中蜜; 取原液1000 mL加入炼蜜350 mL, 继续浓缩至1000 mL, 收膏过滤, 测比重为140 kg/L(80℃测), 即成琼玉膏。SPF BALB/cnu小鼠, 40只, 雄性, 4周龄, 体质量19～22 g, 由中山大学肿瘤研究所提供。所有裸鼠均在无菌条件下按卫生部指导方针由广州中医药大学实验动物中心SPF实验室饲养。液氮冻存人肝癌HepG2215细胞株购自解放军第458全军传染病中心肝病研究所。

　　1.2  方法

　　1.2.1  瘤液制备  人肝癌细胞株经复苏、 传代培养后, 收集生长良好的细胞, 用9 g/L生理盐水悬浮, 调整细胞密度为1×1010/L, 制成人肝癌细胞悬液。以5 g/L台盼蓝染液测定培养细胞活力（活细胞圆形透明, 死细胞蓝色）。

　　1.2.2  模型建立  02 mL人肝癌细胞悬液（密度1×1010/L）于裸鼠背部皮下注射, 建立肝癌模型[5]。 肿瘤直径达到05 cm时默认造模成功。

　　1.2.3  试验分组  将40只BALB/cnu小鼠随机均分为5组（每组8只）: 第1组为QYG预防组, 接种癌细胞前用琼玉膏灌胃预防治疗2周, 1次/d, 剂量14 g/(kg・d); 第2组为QYG治疗组, 接种癌细胞后用琼玉膏灌胃治疗8周, 1次/d, 剂量14 g/(kg・d); 第3组为CTX治疗组, 接种癌细胞后腹腔注射环磷酰胺治疗8周, 每周5次, 剂量4657 mg/kg[6]; 第4组为模型对照组, 接种人肝癌细胞后, 每日以9 g/L生理盐水灌胃, 剂量14 g/(kg・d), 连续8周; 第5组为空白对照组, 02 mL 9 g/L生理盐水于裸鼠背部皮下注射, 之后每日以9 g/L生理盐水灌胃, 剂量14 g/(kg・d), 连续8周。造模后每周测量裸鼠体质量1次。

　　1.2.4  组织标本  肿瘤接种8周后, 体检肿瘤大小, 形状, 质地。随后裸鼠脱颈处死, 肿瘤组织剥离称重, 同时取肝组织。将肿瘤与肝脏组织并用10 mL/L福尔马林固定, 石蜡包埋, 组织切片, 然后进行免疫组化分析。

　　1.2.5  免疫组化  标本包埋切片后置于用多熔素防脱片处理的载玻片上, 56℃乙醇脱水2  h, 在新鲜配制的30 mL/L的双氧水中室温浸泡30 min以灭活内源性过氧化物酶的活性, 然后在去离子水中（每次5 min）和PBS中（每次3 min）各清洗2次, 然后将切片浸于001 mol/L, pH60的枸橼酸盐缓冲液中,  微波照射10 min进行抗原修复, 用蒸馏水冲洗5 min×2次; 01 mol/L PBS冲洗5 min×1次后, 滴加正常山羊血清封闭液, 室温孵育30 min以阻断非特异性的蛋白结合, 随后滴加HBx多克隆抗体在37℃温孵60 min。01 mol/L PBS洗2 min×3次; 滴加生物素标记的羊抗兔IgG, 在室温中温育20 min, 01 mol/L PBS洗2 min×3次; 滴加HRP标记的链亲和素, 37℃温育20 min, 以001 mol/L PBS洗4次; 经DAB显色15 min, 在光学显微镜下读阳性染色细胞。

　　1.2.6  组织分析  以下述免疫组化评判标准对HBxAg表达进行评判: 无细胞染色阳性反应为“－”, <10%细胞染色为“＋”, ≥10%细胞染色为“++”。

　　1.2.7  统计学处理  采用统计学软件SPSS130, 各组间瘤质量的差异采用单因素方差分析, 各组间HBxAg表达程度的差异采用秩和检验, P<005为具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  琼玉膏对裸鼠生长和瘤质量的影响  如表1所示, QYG预防组裸鼠的生长明显快与其他荷瘤组(P<001), 其次为QYG组。CTX治疗组和模型组大鼠生长缓慢, 两组间无统计学差异。各组肿瘤生长状况如表2所示, QYG预防组小鼠, 肿瘤生长缓慢, 3周才造模成功。其余各组小鼠, 肿瘤生长较快, 2周即造模成功。各治疗组瘤质量明显低于模型组, 其中QYG预防组的瘤质量最低。

　　表1  琼玉膏对小鼠体质量增长的影响　略

　　表2  琼玉膏对肿瘤质量的影响　略

　　2.2  琼玉膏对肝组织HBxAg表达的影响  免疫组化分析显示, 模型对照组HBxAg的表达强于QYG预防组和CTX治疗组, 而与QYG治疗组之间无统计学差异。比较各组药物治疗组发现, QYG治疗组的HBxAg表达强于CTX治疗组, 但与QYG预防组相比无统计学差异（图1, 表3）。

　　2.3  琼玉膏对肿瘤组织HBxAg表达的影响  免疫组化染色显示模型对照组HBxAg的表达明显强于QYG预防组和CTX治疗组, 而与QYG治疗组之间无统计学差异。CTX治疗组的HBxAg表达弱于QYG治疗组, 但与QYG预防组相比, 差异无统计学意义(图 2, 表 4)。

　　图1  裸鼠肝脏组织免疫组化染色HBxAg表达的比较　略

　　表3  琼玉膏对肝脏HBxAg表达的影响（略）

　　表4  琼玉膏对肿瘤组织HBxAg表达的影响（略）

　　图2  荷瘤小鼠肿瘤组织免疫组化染色HBxAg表达的比较　略

　　3  讨论

　　HBxAg是一反式激活因子, 可通过与TATA结合蛋白(TATA binding protein, TBP)作用来实现其广泛激活作用[7], 激活致癌基因的表达。一方面, HBx基因可增强胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor 1 receptor, IGF1R）表达, 通过信号通路传导至细胞核, 推进细胞周期[8], 同时降低细胞周期抑制成分p21CIP1/WAF1表达, 增强增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）表达, 使肿瘤细胞增殖形成恶性生长[8]。同时, HBx基因还增强血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达, 通过旁分泌作用使血管内皮增生, 加速肿瘤血管的形成, 为肿瘤的生长提供丰富的血供和营养基础[9]。此外, HBxAg亦可通过抑制C2蛋白途径促进HCC的[10]。HBxAg在乙肝致癌过程中扮演着重要角色, 现已成为新的抗肿瘤药物的作用靶点[11]。本试验我们发现, HBxAg不仅在移植瘤中表达, 还可在荷瘤鼠的肝脏中表达, 显示出HBxAg在肝癌发展中的重要作用。然而空白对照组的肝脏中也有少量HBxAg的表达, 表明HBxAg也可出现在正常肝细胞中。琼玉膏由生地黄、 人参、 茯苓、 蜂蜜四味药配伍而成, 是益气养阴的经典名方。我们前期研究表明其主要成分有抗乙肝病毒和肝纤维化的作用, 并对抑癌基因P21、 P53等的表达有一定促进作用, 但是其是否对乙肝后肝癌及肝癌癌前病变有治疗或预防作用却尚未明确。我们用已转染HBV全基因系列的人肝癌HepG2215细胞株进行传代培养后移植, 建立人肝癌移植瘤模型, 观察琼玉膏治疗前后荷瘤小鼠体质量增长、 肿瘤生长状况及肝组织、 肿瘤组织中HBxAg的表达情况。从结果可以看出, QYG预防后, 小鼠体质量增长极快, 甚至超过了空白对照组, 而CTX治疗后小鼠体质量明显下降, 基本与模型对照组持平, 表明琼玉膏在防治肿瘤发生的同时对机体产生强大的保护作用, 防止肿瘤组织对机体的进一步侵害。而CTX在杀灭肿瘤组织的同时, 也破坏了机体正常的组织, 严重影响了机体的正常生长发育, 机体的整体状况与未经治疗的模型对照组相比, 无统计学意义。此外, 我们还发现, QYG预防、 QYG治疗、 CTX治疗均能不同程度的抑制HBxAg的表达,   并抑制肿瘤的发展, QYG预防还能抑制或减缓肿瘤的发生。对比QYG预防、 QYG治疗、 CTX治疗的疗效可以看出, CTX治疗和QYG预防均能有效杀灭肿瘤组织并降低HBxAg的表达, 效果优于QYG治疗, 而CTX治疗和QYG预防的疗效之间无统计学意义。综上所述, 虽然QYG预防虽不能完全阻止移植瘤的发生, 但可以减慢肿瘤的发展并抑制HBxAg的表达, 后者可能为防治乙肝相关肝癌的重要机制。

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　　[1] 余  冰, 倪  明, 朱慧芬, 等. 可与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体的表达及其特性[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(6): 714-716.

　　[2] Arbuthnot P, Kew M. Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma[J]. Int J Exp Pathol, 2001, 82(2): 77-100.

　　[3] Ogden SK, Lee KC, Barton MC. Hepatitis B Viral Transactivator HBx Alleviates p53mediated repression of αfetoprotein gene expression[J]. J Bio Chem, 2000, 275(36): 27806-27814.

　　[4] Su F, Theodosis CN, Schneider RJ. Role of NKkappaB and myc proteins in apoptosis induced by hepatitis B virus HBx protein[J]. J Virol, 2001,75(1): 215-225.

　　[5] Chan JY, Cheung JY, Luk SC, et al. Anticancer and proapoptotic effects of an herbal medicine and Saccharomyces cerevisiae product (CKBM) on human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in vitro and in vivo[J]. Immunoph Immunot, 2004, 26(4): 597-609.

　　[6] Chen Q. Pharmacological studying method of Chinese herb[M]. 3rd ed. Beijing: people’s sanitation publishing company, 2000: 33-34.

　　[7] Hann HW, Lee J, Bussard A, et al. Preneoplastic markers of hepatitis B virusassociated hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res, 2004, 64(20): 7329-7335.

　　[8] Park US, Park SK, Lee YI, et al. Hepatitis B virusX protein upregulates the expression of p21wafl/cipl and prolongs G1 S transition via a p53independent pathway in human hepatoma cells[J]. Oncogene, 2000, 19(30): 3384-3394.

　　[9] Tao X, Shen D, Ren H, et al. Hepatitis B virus X protein activates expression of IGFIR and VEGF in hepatocellular carcinoma cells[J]. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2000, 8(3): 161-163.

　　[10] Zhang Q, Liu J, Zhang L. Expression and distribution of protein translation initiation factor C2 gene in hepatocellular carcinoma and gastric cancer tissue[J]. Chin J Digest Dis, 2003, 4(1): 23-29.

　　[11] Feitelson MA, Duan LX. Hepatitis B virus X antigen in the pathogenesis of chronic infections and the development of hepatocellular carcinoma[J]. Am J Pathol, 1997, 150(4): 1141-1157