抗α

                   作者：魏万贵 王莉 白云峰 龚毅 顾鸣 朱坚 韩伟 关嵘

【关键词】  玉米赤霉醇;,单克隆抗体;,竞争性ELISA;,交叉反应

　　Preparation and preliminary application of monoclonal antibody against αzearalanol

　　[Abstract]  AIM: To prepare monoclonal antibody (mAb) against αzearalanol (αZER) and develop an immunoassay for the detection of αZER and its analogues residues in food derived from animal tissues. METHODS: αZER was conjugated to BSA as immunogen to immunize BALB/c mice and mAb were prepared by hybridoma technique. mAb’s characteristics (titer, Ig subclass, specificity and relative affinity) were identified by ELISA. Standard inhibitive cure was made and sensitivity of the mAb was identified. 37 samples derived from animal liver were detected for αZER residues by competitive ELISA established in the study. RESULTS: 8 hybridoma cell lines stably secreting antiαZER mAb were obtained. The titer of one of them（4E5）was 5.142×107.The Ig subclass was IgG1.The mAb was specific for αZER and its analogues and had no crossreactivity with other compounds.8 positive results were found from the 37 samples derived from animal liver which were negative detected by HPLC. CONCLUSION: AntiαZER mAb has been prepared successfully. A rapid method using the mAb for detecting αZER and its analogues residues in animal tissues has been established.

　　[Keywords]αzearalanol; monoclonal antibody; competitive ELISA; crossreactivity

　　[摘 要]  目的: 制备抗α玉米赤霉醇（αZER）的单克隆抗体（mAb）, 建立对动物源性食品中残留αZER及其同系物的检测方法。方法: 结合O羧甲基羟胺法和EDC法制备αZERBSA偶联物, 免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb。用夹心ELISA测定mAb Ig亚类; 按Beatty法亲和常数; 间接ELISA法测定效价; 用直接竞争ELISA检测mAb与αZER的同系物、 己烯雌酚、 19去甲睾酮、 链霉素及氯霉素等的交叉反应; 绘制αZER标准品竞争抑制曲线, 检定抗体的灵敏度。用该抗体建立的直接竞争ELISA对37份动物肝组织样品进行检测, 并与HPLC检测结果比较。结果:  紫外线扫描证明, αZERBSA偶联成功。实验获得8株可稳定分泌抗αZER mAb杂交瘤细胞株, 其中1株（4E5）分泌的mAb效价较高, 为5.142×107, 其Ig亚型为IgG1。该mAb能特异识别αZER及其同系物, 而与其它常用兽药无交叉反应。建立了αZER直接竞争ELISA, 从HPLC确认为阴性的37份样品中, 筛出8份阳性样品。结论: 利用mAb建立的直接竞争ELISA检测方法, 适合动物源性食品中残留αZER及其同系物的快速筛选。

　　[关键词]玉米赤霉醇; 单克隆抗体; 竞争性ELISA; 交叉反应
   
　　玉米赤霉醇（αzearalanol, αZER）又称右环十四酮酚, 具有动物性雌激素样生物学活性。曾作为兽药使用, 具有催生长、 提高瘦肉率的药物特性, 在促进畜牧养殖业中发挥了重要作用[1,2]。由于其可在动物组织中蓄积并随着食物链进入人体或通过动物的排泄物污染环境, 对人体健康和环境产生危害与长远影响, 随着食品安全与环境保护的日益受重视, 动物源性食品中农兽药的残留日益受到关注[3], 殴美各国已制订了各类兽药在进口食品中严格的残留限量标准, 并建立了相应检测技术[4], 在此形势下, 建立具有我国自主知识产权的快速检测残留农兽药技术, 对提高食品安全的管理水平至关重要。本研究旨在制备抗αZER的mAb, 利用该抗体建立直接竞争ELISA, 检测动物源性食品中αZER及其同系物残留。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  BALB/c小鼠购自院上海实验动物中心。Sp2/0细胞由本公司提供。αZER、 玉米赤霉烯酮（zearalezone）、 碳二亚胺（EDC）、 辣根过氧化物酶（HRP）、 N羟基琥珀酸亚胺（Nhydroxysuccinimide）、 鉴定mAbIg亚类的标准试剂, 均为Sigma公司产品。N,N二环乙基碳二亚胺(DCC)为Aldrich公司产品。吡啶、 盐酸羧甲基羟胺(carboxymethoxylamine) 为Fluka公司产品。β葡萄糖醛酸糖苷酶（βglucuronidase）为Merck公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  抗原的制备  （1）αZER的化学修饰: 将10 mg αZER溶于0.5 mL吡啶, 加入20 mg 盐酸羧甲基羟胺, 室温搅拌24 h, 真空抽干, 加10 mL去离子水, 用2 mol/L NaOH调节pH, 振荡直至残留物全部溶解。用苯抽提, 除去未转化的αZER。然后用2 mol/L HCl调节pH至3, 用乙酸乙酯萃取3次, 真空抽干萃取液, 用1∶1甲醇水溶液重结晶[5]。（2）免疫抗原及检测抗原的制备: 称20 mg BSA溶于2 mL去离子水, 取约5 mg αZER衍生物溶于1 mL 1, 4二氧六环中, 混合这两种溶液, 室温搅拌, 用2 mol/L HCl调节pH 至6, 缓慢加入100 mg EDC, 室温搅拌24 h, 再加100 mg EDC, 室温搅拌48h, 透析, 用紫外线扫描测定偶联率。（3）αZERHRP的制备: 将1 mg αZER衍生物溶解于0.3 mL二甲基甲酰胺, 依次加入2 mg N羟基琥珀酸亚胺, 2 mg DCC, 室温搅拌过夜, 离心, 取0.1 mL上清液, 加入1 mL pH80.2 mol/L PBS溶液（含2 mg HRP）, 充分混合, 37℃温浴0.5 h, 4℃过夜[6], 用Sephadex G25柱纯化, 收集第1个峰,    浓缩, -20℃保存。

　　1.2.2  杂交瘤细胞株的建立  将αZERBSA（50 μg/只）与福氏完全佐剂乳化后,  对BALB/c小鼠腹腔及背部多点 注射。首次免疫3周后, 再用αZERBSA（50 μg/只）与福氏不完全佐剂乳化后, 每隔2周加强免疫1次, 共免疫4次。末次免疫后第3天进行细胞融合。杂交瘤细胞的筛选、 克隆化、 冻存、 腹水制备均按常规方法进行[7]。

　　1.2.3  mAb的纯化  将腹水1∶3的比例用pH7.40.01 mol/L PBS稀释, 经滤纸过滤, 用饱和硫酸铵盐析法沉淀, 弃上清, 用pH7.40.01 mol/L PBS溶解沉淀, 透析。

　　1.2.4  mAb的特性鉴定  （1） mAb Ig亚类的鉴定: 用标准的抗小鼠IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM和IgA 包板, 依次与杂交瘤细胞的培养上清及羊抗鼠 IgGHRP反应, 作夹心ELISA测定。（2）mAb亲和常数的测定: 分别用浓度为2.0μg/L、 8.0 μg/L的αZEROVA 包板, 4℃过夜后, 加100   μL浓度为10 mg/L BSA, 37℃封闭1 h, 洗涤后加入稀释度分别为1∶1000、 1∶10000、 1∶50 000、 1∶250000、 1∶1250000、 1∶6250000、 1∶31250000的腹水各100 μL, 进行间接ELISA测定, 按Beatty法[8]mAb的亲和常数。（3）mAb效价的测定: 以羊抗鼠IgG作为检测抗原包孔, 取小鼠腹水做倍比稀释, 并以Sp2/0细胞诱生的腹水作阴性对照, 间接ELISA法测定mAb效价。（4）mAb特异性鉴定: 以适量mAb包孔, 各孔加50 μL最适浓度的αZERHRP分别与50 μL α玉米赤霉醇、 β玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、 玉米赤霉烯酮、 α玉米赤霉烯醇前体、 β玉米赤霉烯醇前体、 己烯雌酚、 19去甲睾酮、 链霉素及氯霉素溶液（浓度分别为0.5 μg/L、 1 μg/L、 5 μg/L; 用含10 mL/L甲醇的pH7.40.01 mol/L PBS配制）, 按直接竞争ELISA测定mAb与上述化合物的交叉反应性。

　　1.2.5  直接竞争ELISA的建立  (1)αZER的定量检测标准点的设置: 参照欧美等国对进口动物源性食品中αZER残留限量标准和我国国标[4], 在定量检测区域内设定αZER标准点,  配制αZER含量为0.125、 0.25、 0.5、 1.0、 5.0 μg/L的标准品溶液和含αZER浓度为0 μg/L的零标准。（2）以方阵法确定最适量mAb包孔浓度和αZERHRP的工作浓度: 以不同稀释度的mAb包孔, 配制不同稀释度的αZERHRP。在αZER和αZERHRP竞争结合mAb时, 当αZER的浓度为0 μg/L所获得的A450 值为1.0～1.5时, 即为最适 mAb 包孔浓度和αZERHRP工作浓度。（3）标准曲线的绘制: 以上述确定的标准做直接竞争ELISA, 用4次以上竞争ELISA所获A450值的平均值绘制标准曲线。

　　1.2.6  mAb在检测动物组织中αZER残留的初步应用  (1)检测样品的选择: 以上海出入境检验检疫局食品检测检中心2004年农兽药残留监控的部分样品（兔肝12份、 牛肝10份、 鸡肝15份）做实验标本, 同时设添加αZER作为阳性对照, 以HPLC法确证为阴性组织样品作阴性对照。（2）组织样品的预处理: 取1 g粉碎样品于2 mL蒸馏水中, 加8 μL βglucuronidase匀浆, 置37℃孵育2 h, 之后用乙醚萃取, 氮气吹干, 用1 mL氯仿溶解, 加3 mL的1 mol/L NaOH, 充分振荡, 离心, 取上层液, 加入900 mL/L 醋酸250 μL, 再用乙醚萃取, 吹干, 用0.5 mL样品稀释缓冲液溶解。（3）添加回收实验: 取1 g粉碎样品于2 mL蒸馏水中, 定量加入αZER, 匀浆, 4℃放置过夜, 随后按上述方法萃取。（4）直接竞争ELISA测定: 按照1.2.5建立的直接竞争ELISA测定提取的样品, 并以0.01 mol/L PBS（pH7.4, 含0.5 mL/L Tween20）作空白对照, 同步做2条标准曲线。此时如待测样品实际含量超过检测范围, 可将待测样品稀释若干倍再作测定。（5）按照1.2.5建立的方法绘制标准曲线, 对照标准曲线判读待测样品中αZER残留量。

　　1.2.7  mAb在检测动物组织中αZER残留与HPLC同步分析的的灵敏度对比实验  将上述组织提取样品进行HPLC分析, 以αZER残留限量为标准, 将所获数据与用ELISA法在相对应的组织样品检测中所获得数据进行比较, 评判mAb在检测动物组织中αZER残留的灵敏度。

　　2  结果

　　2.1  αZERBSA抗原偶联物的紫外吸收光谱的鉴定  偶联物的紫外吸收光谱与BSA明显不同, 分别在波长357 nm（为αZER的特征吸收峰）和280 nm（为BSA的特征吸收峰）处有吸收峰（图1）, 初步表明偶联成功。

　　图1  BSA和αZERBSA的紫外吸收图谱　略

　　2.2  杂交瘤细胞系的建立  经αZERBSA多次免疫, 小鼠血清效价均在1∶104以上, 经细胞融合及多次克隆化, 共筛选出8株阳性的杂交瘤细胞。经冻存, 复苏后, 均能稳定分泌mAb, 其中1株（4E5）分泌的mAb效价较高, 为5.142×107。对其进行Ig亚类鉴定, ELISA结果显示, 人抗小鼠IgG1包孔A450的值明显高于其他孔, 提示该株mAb的Ig亚类为IgG1。按Beatty等[8]的方法计算, mAb亲和常数为8.3×1012。分别取α玉米赤霉醇、 β玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、 玉米赤霉烯酮、 α玉米赤霉烯醇前体、 β玉米赤霉烯醇前体、 己烯雌酚、 19去甲睾酮、 链霉素及氯霉素与αZERHRP竞争结合抗αZER mAb, 测定mAb的特异性, 竞争ELISA的结果显示, mAb与αZER、 玉米赤霉烯酮、 α玉米赤霉烯醇前体等同系物具有明显的竞争性浓度梯度反应, 而与其他化合物则没有类似的交叉反应（表1）。

　　表1  mAb与αZER同系物及动物常用药的交叉反应性　略

　　2.3  αZER标准品竞争抑制曲线  配制αZER含量为0.125、 0.25、 0.5、 1.0、 5.0 μg/kg的标准品溶液, 进行竞争ELISA测定, 同时以pH7.40.01 mol/L PBS作为空白对照, 以A450%（A450%=A450样品/A450空白对照×100%）作为纵坐标, 标准品的浓度作为横坐标, 绘制曲线图, 所得结果具有很好线性关系（图2）。

　　图2  αZER的竞争抑制曲线　略

　　2.4  竞争ELISA与HPLC检测的结果比较  将37份动物组织样品(兔肝: R1000～R1011; 牛肝: C2000～C2009; 鸡肝: P0001～P0014)经HPLC确证为阴性者, 而经抗αZER mAb进行直接ELISA法检定, 检出8份阳性样品（约占8/37份）。设添加样品作为阳性对照, 以阴性组织基质作为阴性对照, 以0.01 mol/L pH7.4 PBS（含0.5 mL/L Tween20）作空白对照, 3种对照的检测结果均正确, 说明直接ELISA检测的结果是可信的（表2）。

　　表2  竞争ELISA与HPLC检测结果的比较　略

　　3  讨论

　　αZER及其同系物属于小分子羟基类化合物, 化学结构类似[5]本身无免疫原性, 必须与大分子蛋白偶联。但αZER的分子内并无有效的偶联活性基团, 必需对其它基团进行化学修饰。有研究者通过琥珀酸酐法修饰αZER分子上的羟基[9], 衍生出带有4个碳链的羧基再与大分子蛋白偶联, 获得高质量的抗体。但αZER分子上有3个羟基, 这样偶联可能会出现异构体而影响抗体的特异性。我们尝试利用αZER分子脂肪链上惟一的羰基功能基团, 通过O羧甲基羟胺法引入1个活性的羧基,   然后用EDC法进行偶联, 以这种方式合成的抗原由于没有异构体, 能最大限度保证诱生抗体的特异性。实验结果显示, 此法制备的偶联物是理想的免疫抗原。另外, 我们用N羟基琥珀酸亚胺法, 将上述方法改造过的αZER与HRP相联, 则可能有效地避免了用同一种方法偶联可能对ELISA检测的灵敏度产生影响。用传统方法检测动物源性食品中玉米赤霉醇及其同系物的残留量, 前处理费时, 灵敏度低, 检测成本颇高, 如HPLC, TLC（HPLC检测极限为10 μg/kg; TLC检测极限为200 g/kg）等[1]。而酶联免疫法则具有简便, 灵敏等特点, 检测极限一般可达0.1 μg/kg, 用本研究中所得的mAb与αZER标准品做直接竞争ELISA也能达到这一检测极限。用于动物组织αZER残留回收样品的测定, 显示具有明显的高灵敏度和专一性。另外竞争抑制曲线标准点的设置也会影响检测的灵敏度, 我们将竞争抑制曲线标准点检测范围设定为0～5 μg/kg, 在该范围内得到的工作曲线线性好, 能够满足各国对进口动物性食品中药物残留检测最高限量值（MRL）判读要求。我们在制备抗体时, 总是希望得到的抗体尽可能专一, 然而在繁琐的动物原性食品药物残留检测中, 抗体与其同系物的交叉反应对大量样品的筛选反而有利。本研究用4E5杂交瘤细胞制备mAb, 特异性鉴定表明, 该mAb与αZER及其同系物均可发生反应, 而且其检测的灵敏度都能达到残留检测限量要求。如果利用mAb（4E5）与αZER及其同系物交叉反应性, 应用于大规模动物源性食品中该类药物残留筛选, 就可一次检出残留的αZER及其同系物, 因此具有良好的应用前景。

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