人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

                 作者：李珊, 潘全, 李云龙, 叶昕

【关键词】  Cyclin,E;,基因克隆;,原核表达

　　[摘 要]  目的: 构建人Cyclin E基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中表达并纯化。方法: PCR扩增人Cyclin E基因片段, 并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中, 构建重组质粒pET32a(+)Cyclin E。经限制性内切酶EcoR I 与Xho I双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果: 获得全长约为1200 bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a(+)Cyclin E转化E.coli BL21后, 经IPTG诱导, 表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDSPAGE、 Western  blot分析显示, 诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论: 成功地构建了表达载体pET32a(+)Cyclin E, 并表达出重组蛋白HisCyclin E, 为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。

　　[关键词]Cyclin E; 基因克隆; 原核表达
   
　　细胞周期是一个连续动态、 多阶段、 多因子参与的精确而有序的调控过程, 可分为5个时期: 即G0期、 G1期、 S期、 G2期、 M 期,  有G1/S 限制点和G2/M两个限制点。在哺乳动物细胞周期的运行中, 有许多酶参与, 其中最核心的酶是由一组作为催化亚基的周期蛋白依赖激酶(CDK) 和一组作为调节亚基的周期蛋白(Cyclins) 组成的异二聚复合体[1], 两者结合后形成细胞周期调节复合物(cyclinCDK)并具有激酶活性, 能磷酸化细胞周期中相应的细胞因子以推进细胞周期的进行。在细胞周期蛋白中, Cyclin E属于G1期细胞周期的正调节因子, 参与G1/S转换点功能的调控, 与其他参与G1/S转换点功能调控的因子Cyclin DS、 抑癌基因视网膜神经胶质细胞瘤蛋白[2] (retinoblastoma protein, Rb)、 转录因子E2F、 抑癌基因p53、 KIP家族、 CDK2、 4、 5等相互作用共同决定细胞的生存和凋亡。而一旦细胞进入S 期Cyclin E即被泛素化降解。细胞周期调控是当前肿瘤学研究的热点, 细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关。为此, 我们构建人Cyclin E基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21 中表达, 为今后发现并研究Cyclin E/Cdk2的新底物奠定了基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  EcoR I, Xho I, T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Tiangen公司。AntiRabbit IgG HRP 购自美国Promega公司。IPTG 购自Merk公司。DNA ladder由北京Tiangen公司提供。pDESTCyclin E载体、 pET32a(+)载体、 E.coli BL21、 及兔源antiCyclin E抗体, 由本实验室保存。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人Cyclin E的PCR扩增  根据Cyclin E的序列设计特异性引物, 将其从pDESTCyclin E载体上克隆。上游引物序列为: acgtgaattcatgaaggaggacggcggcgc; 下游引物的序列为: tagcctcgagtcacgccatttccggcccgctg, 其中下划线分别为EcoR I 与Xho I酶切位点, 引物均由北京英骏公司合成。PCR反应条件: 95℃ 5 min, 95℃ 1 min, 50℃ 45 s, 72℃ 1 min, 循环30次后, 72℃延伸5   min。

　　1.2.2  原核表达载体pET32a(+)Cyclin E的构建  用EcoR I、 Xho I 分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒, 经琼脂糖凝胶回收, 将载体和目的片段用T4连接酶4℃连接过夜。 将连接的重组质粒pET32a(+)Cyclin E转化E.coli DH5α, 在含有50 mg/L氨苄的LB琼脂糖培养基中于37℃培养过夜。挑选阳性克隆, 扩增后提取质粒, 并用EcoR I 与Xho I酶切鉴定。

　　1.2.3  人HisCyclin E融合蛋白的诱导表达  将重组质粒pET32a(+)Cyclin E转化E.coli BL21, 在含50 mg/L氨苄的LB培养基中摇菌过夜, 后以1∶100转接到新鲜的含50 mg/L氨苄的LB培养基。37℃摇菌2.5 h后, 加入IPTG至终浓度0.6 mmol/L, 37℃诱导4 h, 5000 r/min离心10 min收菌。菌体用PBS洗涤1次, 后加入超声液(20 mmol/L Na2HPO4, 0.5 mol/L NaCl, 10 mmol/L imidazole, 1 mmol/L PMSF)重悬, 以超声5 s, 间隔10 s, 全程时间20 min, 保护温度8℃超声破菌,12000 g离心20 min, 取上清进行SDSPAGE, 分析HisCyclin E的诱导表达情况。

　　1.2.4  人HisCyclin E纯化  将HisCyclin E上清加入NiNTA Beads中, 4℃结合2 h, 加入5倍柱体积的Washing Buffer(20 mmol/L Na2HPO4, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L imidazole, 2%Triton X100, pH7.4)在混合器上洗涤10 min后, 分别用1mL 50 mmol/L, 75 mmol/L, 100 mmol/L, 125 mmol/L, 150 mmol/L的Elution Buffer(20 mmol/L Na2HPO4, 0.5 mol/L NaCl, 500 mmol/L imidazole, pH7.4)进行梯度洗脱。

　　1.2.5  人Cyclin E检测  将未诱导的pET32a(+)全菌液和纯化的Cyclin E蛋白进行100 g/L的SDSPAGE胶电泳, 16V转膜8 h, 50 g/L的脱脂奶粉室温封闭2 h, 一抗室温孵育1 h, TBST洗3次, 每次10 min, 二抗室温孵育1 h, TBST洗3次, 每次10 min。

　　2.1  重组质粒的双酶切鉴定  将重组质粒用EcoR I 与Xho I酶切后, 经琼脂糖凝胶电泳分析表明, 质粒约为7000 bp, HisCyclin E基因片断约为1188 bp, 均符合预期的结果（图1）。

　　图1  重组质粒 pET32a(+)Cyclin E的酶切鉴定　略

　　2.2  重组质粒pET32a(+)Cyclin E的诱导表达  以重组质粒pET32a(+)Cyclin E转化E.coli BL21菌, 经终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导4 h。经SDSPAGE分析表明, 在Mr大约 66000左右有明显的差异条带, 与预期的理论值基本相符(图2)。将诱导纯化的蛋白做Western blot 分析证明确实为Cyclin E。

　　图2  重组质粒pET32a(+)Cyclin E诱导表达的SDSPAGE分析　略

　　3  讨论

　　Cyclin E是由Koff 等[4]于1991年发现的, 人Cyclin E基因定位于19q1219q13, 包含4个外显子和3个内含子。Cyclin E基因转录产物存在选择性剪切, 其mRNA产物有两种, 分别编码Mr397000和41000的蛋白。在细胞周期中Cyclin E的表达水平随细胞周期波动, 在G1晚期或S早期达高峰, 之后迅速下降, 主要与其周期性合成与降解有关[5]。Cyclin E过表达有助于细胞从G1期提早进入S期, 导致细胞增生及恶性增生.有报道在许多恶性肿瘤组织中Cyclin E呈过量表达现象[6]。Peng等[7]研究了Cyclin D1和Cyclin E异常表达及在肝癌中的作用, 发现71例肝癌患者中有40例Cyclin E mRNA过度表达, 且与低分化肝癌密切相关, 提示Cyclin E的异常表达与肝癌生物学行为有关。CDK2的激酶活性需要Cyclin E的结合, 原核表达的Cyclin E可与CDK2一起进行体外激酶反应的, 对CDK2 的底物的磷酸化研究有重要作用。同时, 纯化的Cycllin E可作为诱饵蛋白筛选与Cyclin E/CDK2 复合物相互作用的蛋白, 对细胞周期尤其是G1/S检验点的调控机制的研究有重要意义。目前, Cyclin E的表达在均为真核表达, 蛋白的表达量都受到限制, 为此我们参照文献[8]表达并纯化了人源Cyclin E蛋白, 该蛋白的原核表达及纯化在国内尚为首例。纯化的大量的hiscyclin E的蛋白, 将对后续的体外激酶反应以及筛选与其相互作用的蛋白起到重要作用。同时, Cyclin A作为与CDK1结合的蛋白, 对细胞周期的调控也有重要影响, 我们目前正着手其克隆及其原核表达。

　　文献:

　　[1] Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, et al. P27kipl, a CyclinCdk inhibitor links transforming growth factorb and contact inhibition to cell cycle arrest[J]. Genes Dev, 1994, 8(1): 9-22.

　　[2] Kim YT, Zhao M. Aberrant cell cycle regulation in cervical carcinoma[J]. Yonsei Med J, 2005, 46(5):  597-613.

　　[3] ZajacKaye M. Myc oncogene: a key component in cell cycle regulation and its implication for lung cancer[J]. Lung Cancer, 2001, 34 (2): S43-46.

　　[4] Koff A, Cross F, Fisher A, et al. Human Cyclin E, a new cyclin that  interacts with two members of the CDC2 gene family[J]. Cell, 1991, 66(6): 1217-1228.

　　[5] Dulic V, Lees E, Reed SI. Association of human Cyclin E with a periodic G1S phase protein kinase[J]. Science, 1992, 257(5078): 1958-1961.

　　[6] Erlandsson F, Wahlby C, EkholmReed S, et al. Abnormal expression pattern of cyclin E in tumour cells[J]. Int J Cancer, 2003, 104(3): 369-375.

　　[7] Peng SY, Chou SP, Hsu HC. Association of downregulation of cyclin D1 and of over expression of cyclin E with p53 mutation, high tumor grade and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 1998, 29(2): 281-289.

　　[8] 姚  丽, 李  青, 李  蓬, 等. 人CIDE3 基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(2): 202-204.