人MBL
作者：蔡学敏, 左大明, 赵娜, 张丽芸, 陈政良
【关键词】 甘露聚糖结合凝集素;,胶原样区;,原核表达
Construction of the expression vector pET32a/His MBLCLR and its expression in E.coli
[Abstract] AIM: To construct pET32a/His MBLCLR recombinant prokaryotic expression plasmid and to express mannanbinding lectinCLR (MBLCLR) protein in E.coli METHODS: The human MBLCLR gene was amplified by PCR from pGEMMBL plasmid, and was inserted into prokaryotic expression vector pET32a. After identified by restriction mapping and sequencing, the recombinant plasmid pET32a/His MBLCLR was transformed into E.coli BL21 (DE3) cells. The expressed product was purified by Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) and identified by SDSPAGE, Western blot and indirect enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）using the antibody from BALB/c mice immunized with the recombinant human MBL protein.RESULTS: The cDNA fragment of 180bp was amplified from pGEMMBL plasmid and the recombinant expression vector pET32/His MBLCLR was constructed. The recombinant plasmid was consistent with those expected by restriction maps and sequence. Three components of Mr 30000, 60000 and 120000 in the purified recombinant product were detected by SDSPAGE and all the components could be recognized by anti6His antibody in Western blot assay. The three components were correspondingly with the band of the monomer and oligomer of the fusion protein. The purified recombinant product could react with the antibody against the recombinant human MBL protein in the indirect ELISA. CONCLUSION: The prokaryotic expression strains that efficiently express recombinant human MBLCLR and the recombinant human MBLCLRTrx fusion protein were obtained successfully, which will help the further structurefunction research of MBL molecule.
[Keywords]mannanbinding lectin; collagenlike region; prokaryotic expression
[摘 要] 目的: 在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法: 应用PCR技术,从含人野生型MBL cDNA的质粒pGEMMBL中扩增CLR基因片段, 将其克隆至pET32a原核表达载体后, 转化E.coli BL21(DE3)感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni2+NTA 琼脂糖柱层析纯化目的蛋白, 以SDSPAGE、 Western blot和ELISA法进行鉴定。结果: 从重组质粒pGEMMBL中扩增到长约180 bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamH I和Hind Ⅲ酶切后出现约5900 bp和180 bp的片段, 测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后, 纯化的蛋白经SDSPAGE电泳出现Mr约为30000、 60000和120000的3条带。Western blot分析表明, 3条蛋白带均可与抗His抗体起反应, 3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实, 纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论: 获得可表达人MBLCLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBLCLRTrx融合蛋白, 为MBL分子结构、 功能关系的进一步研究提供了条件。
[关键词]甘露聚糖结合凝集素; 胶原样区; 原核表达
甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin, MBL）是C型凝集素超级家族中胶凝素家族的成员。成熟的MBL 肽链自N 端至C 端依次有富含Cys 的N 端区、 胶原样区（collagenlike region, CLR）、 颈区和C端糖识别域（carbohydraterecognition domain, CRD）。CRD是MBL识别的功能区, 可选择性地识别多种病原体表面以Man、 ManNAc、 GlcNAc或Fuc等为末端糖基的糖结构。CLR为MBL的效应功能区, 可介导补体激活和调理吞噬。其补体激活作用勿需C1和抗体参与, 而是通过活化2个MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBLassociated serine proteases, MASP1和MASP2）而实现的。该作用能直接杀菌和溶解病毒, 还可通过产生C3b/C4b起间接调理作用。MBL能籍其CLR与吞噬细胞表面的胶凝素受体结合, 介导直接调理功能[1, 2]。然而, MBL与补体激活及其结合胶凝素受体的结构基础尚不清楚, 因而不能明确阐述CLR的结构与功能的关系。而且, 由于MBL基因点突变引起的免疫缺损是迄今所发现的最常见免疫缺损病。导致该缺损的3个点突变均位于编码CLR的外显子1, 可导致成熟的MBL肽链中第32、 34和37位氨基酸残基改变, 但其发病机制迄今不明[3]。因此, 研究MBL分子CLR的结构与功能的关系, 对于阐明MBL介导天然免疫防御功能的机制以及MBL缺损的发病机制均具重要意义。为此, 构建了MBLCLR基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中高效表达MBLCLRTrx融合蛋白, 为后续有关的研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 含中国人野生型MBL全长编码区cDNA的pGEMMBL质粒[4]和小鼠抗人MBL抗体[5]及小鼠抗人MBLCRD抗体均由本室制备。质粒pET32a、 感受态大肠杆菌TOP10F和BL21(DE3)由本室保存; 限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ、 T4 DNA连接酶、 Taq DNA聚合酶、 dNTP、 低分子量蛋白marker、 DL2000和DL15000 DNA marker及HRP羊抗鼠IgG抗体, 均购自大连宝生物公司。PCR产物回收试剂盒、 小量DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒, 均购自杭州维特洁公司。HRP抗His抗体购自晶美公司。Ni2+NTA 琼脂糖层析柱购自Qiagen公司。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体pET32aMBLCLR的构建 根据中国人野生型MBL全长序列设计一对特异性引物, 上游引物的序列为: 5′CGGGATCCGGCATCAACGGCTTCCCAG3′, 含有BamHⅠ的酶切位点; 下游引物的序列为: 5′CCGAAGCTTACTTTTTCCAGGGTCTCC3′, 含有Hind Ⅲ的酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pGEMMBL质粒为模板, 采用上述引物扩增MBLCLR基因片段, 并以PCR产物回收试剂盒进行回收。以BamH I和Hind Ⅲ 双酶切MBLCLR基因片段和pET32a质粒DNA, 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳和凝胶回收试剂盒回收后, 以T4 DNA连接酶连接。以连接产物转化感受态的大肠杆菌TOP10F, 将菌液涂于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上, 培养后, 挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中, 于37℃振荡培养12 h。提取质粒, 以BamH I和Hind Ⅲ 双酶切并测序（由上海博亚公司完成）进行鉴定。鉴定正确的质粒命名为pET32aMBLCLR。
1.2.2 MBLCLRTrx融合蛋白的诱导表达 以鉴定正确的重组表达质粒转化感受态的E.coli BL21 (DE3)中, 取菌液涂于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上, 挑取单个菌落, 接种于含相同浓度的氨苄青霉素的LB液体培养基中, 于37℃振荡培养过夜。按1%转种于同一种培养基中, 于37℃振荡培养至A600=0.6~1.0, 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 诱导培养4 h。取1 mL菌液, 制成蛋白电泳样品, 采用SDSPAGE进行鉴定。大量培养工程菌, 以IPTG诱导表达后, 离心收集菌体。用1/10 培养基体积的缓冲液A（10 mmol/L咪唑、 300 mmol/L NaCl及50 mmol/L NaH2PO4, pH8.0）悬浮并沉淀细菌, 经超声破碎后, 于4℃以10000 g离心10 min。分别收集上清和沉淀, 制样进行SDSPAGE分析。
1.2.3 重组表达蛋白的纯化及其鉴定 （1）MBLCLRTrx蛋白的纯化: 收集上清加于经缓冲液A平衡的Ni2+NTA亲和层析柱,然后用缓冲液B（20 mmol/L咪唑、 300 mmol/L NaCl及50 mmol/L NaH2PO4, pH8.0）洗柱及用缓冲液C（250 mmol/L咪唑、 300 mmol/L NaCl及50 mmol/L NaH2PO4, pH8.0）洗脱目的蛋白。洗脱的目的蛋白经超滤浓缩后, 于透析液（50 mmol/L PBS, pH7.2）充分透析除去咪唑及盐, 即为纯化的MBLCLRTrx蛋白。（2）SDSPAGE和Western blot鉴定: 将纯化的MBLCLRTrx蛋白经SDSPAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜上, 将膜置于30 g/L的脱脂奶粉溶液中于4 ℃封闭过夜。然后滴加HRP抗His抗体于37℃反应2 h, 最后用DAB显色试剂盒显色。（3）ELISA检测: 将MBLCLRTrx蛋白从20 mg/L倍比稀释至0.6 mg/L, 将未转入目的质粒的BL21(DE3)空菌的菌体蛋白也作同样的稀释作为阴性对照, 加入到酶联板中, 100 μL/孔, 于4℃过夜包被; 加入50 g/L脱脂奶粉, 于37℃封闭2 h洗板后, 加入1∶1 000鼠抗人MBL抗体; 对照试验加入1∶1000鼠抗人MBLCRD抗体, 37℃温育1 h, 洗板后, 加入1∶3000 HRP羊抗鼠IgG（同前述）。加OPDH2O2底物液显色后, 以2 mol/L H2SO4终止反应, 用自动酶联仪上测定A490值。
2 结果
2.1 pET32aMBLCLR重组表达载体的构建 使用特异性引物对进行PCR, 从含人野生型MBL cDNA的质粒pGEMMBL中, 扩增出约180 bp的目的基因片段。将其插入原核表达载体pET32a中构建重组表达载体pET32aMBLCLR。经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后, 出现约5900bp和180bp的条带, 前者为双酶切后的载体片段, 后者为双酶切后的目的DNA片段（图1）。插入的DNA片段的大小为177 bp。测序结果同预期的完全一致, 表明重组表达载体pET32aMBLCLR构建成功。
图1 重组质粒pET32a/His MBLCLR的酶切鉴定 略
2.2 重组表达载体在大肠杆菌中的表达 SDSPAGE分析表明, 与空菌BL21(DE3)相比较, 重组子pET32aMBLCLR在Mr30000处分别有一条较浓的蛋白带, 与预期的结果相符。扩大培养后, 收集细菌经超声破碎及离心分离上清和沉淀, 分别进行SDSPAGE分析发现, 重组蛋白主要存在于上清中, 表明MBLCLRTrx融合蛋白为可溶性表达（图2）。
图2 重组表达产物的SDSPAGE分析 略
2.3 重组蛋白的纯化与鉴定 将收集的MBLCLR BL21(DE3)菌体裂解液通过Ni2+NTA 琼脂糖柱纯化后, 进行SDSPAGE分析并用抗His抗体对重组蛋白进行Western blot分析, 发现在Mr30000、 60000和120000处均有条带（图3）。ELISA证实, 重组蛋白能与小鼠抗重组人MBL抗体结合（图4）, 而与小鼠抗人MBLCRD抗体不结合（数据从略）, 显示了该蛋白与抗体结合的特导性。表明本实验已获得了MBLCLR原核表达菌株, 并纯化得到了MBLCLRTrx融合蛋白。
图3 纯化的重组表达产物的SDSPAGE和Western blot分析 略
图4 重组MBLCLRTrx与抗MBL抗体的反应性 略
3 讨论
人MBL基因位于染色体1q1121q21, 长约7 kb, 含4个外显子。成熟MBL肽链含228个氨基酸残基, 包括21氨基酸个残基的N末端区（含3个Cys）, 59个氨基酸残基的GlyXY重复顺序CLR（19个GlyXY重复和第7、 8位GlyXY之间的GlyGln）和24个氨基酸残基的颈区和124个氨基酸残基的C末端CRD[4]。人MBL肽链的Mr约为28000~32000, 3条肽链通过N端区的Cys形成二硫键而连接, CLR相互缠绕成α螺旋, 3个CRD在C端形成球形头部。此结构单位又籍二硫键或非共价键连接成寡聚体, 多至六聚体。只有三聚体以上的寡聚体才具有生物学活性[6, 7]。胶原蛋白的3条肽链相互缠绕成α螺旋是依其本身性质而进行的一个自装配过程, 从而可形成具有生物学活性的胶原蛋白的三级结构。因此, 本实验设计了一对特异性引物, 从建立的含中国人野生型MBL全长编码区cDNA的pGEMMBL质粒中, 扩增出MBL的CLR基因片段, 将其插入原核表达质粒pET32a中, 构建了重组表达载体, 并在大肠杆菌中表达。实验所选用的表达载体pET32a是一种融合表达质粒, 除能在外源蛋白的N端编码6个组氨酸残基外, 还能够编码硫氧环蛋白（Thioredoxin, Trx）, 其与外源蛋白的融合表达可增加表达产物的可溶性, 还可保护外源蛋白不易被降解。融合蛋白中的外源蛋白与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点, 可方便地切下Trx, 使表达的人MBLCLRTrx的构象及活性与天然蛋白更接近。我们将收集的菌体裂解液通过Ni2+NTA琼脂糖柱纯化后, 进行SDSPAGE以及Western blot分析显示, 出现Mr为30000、 60000和1200003条蛋白带。Mr为30000的蛋白带与MBLCLRTrx单肽链的Mr相符。我们推测, Mr为60000和120000的蛋白带为MBLCLRTrx 的多聚体形式, 即2条或4条肽链连接形成的双体或四聚体, 但CLR为何会形成四聚体及其生物学活性如何？以及在什么条件下才更多地形成三聚体等？均有待研究。纯化的重组表达产物能与鼠抗重组人MBL的抗体起反应, 表明所获表达产物确实是人MBLCLRTrx蛋白。MBL是天然免疫系统中的重要分子[8]。而且, MBL 结构基因点突变的频率极高[9], 可引起血清MBL水平低下及活性降低从而导致调理吞噬作用缺损, 表现为各种病原体的反复急慢性感染, 甚至HBV、 HIV等病原体的感染及疾病的也与MBL缺损有关[10, 11]。MBL基因的突变还与自身免疫病如（SLE、 RA、 IgA肾炎及皮肌炎等）密切相关[12], 进一步佐证了MBL的重要性。然而, 目前MBL分子的结构与功能的关系尚不清楚, MBL结构基因的点突变引起调理吞噬缺损的机制也不清楚, 均需进一步研究阐明。本实验建立的可制备大量高纯度的人野生型MBLCLRTrx蛋白的方法, 为后续有关的研究奠定了基础。
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