大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体的构建
作者：祝建波 史芳芳 王冬梅 周鹏
【关键词】 大肠杆菌;,不耐热毒素LT;,植物疫苗;,载体构建,
[摘 要] 目的: 构建可高效表达不耐热肠毒素LT的双价植物表达载体。方法: 采用PCR的方法从强致病菌株中K88ac中, 分别克隆了LTA和LTB基因, 将LTA和LTB基因同时连接到植物表达载体pBI121上。结果: 成功构建了带有内质网滞留信号RDEL/KDEL的不耐热肠毒素A、 B亚单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300LTALTB。结论: 构建的双价植物表达载体pCAMBIA2300LTALTB, 为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。
[关键词]大肠杆菌; 不耐热毒素LT; 植物疫苗; 载体构建
添加免疫佐剂是提高免疫反应强度的有效方法, 在非植物疫苗中已经被多次证实。在植物疫苗中, 在抗原基因转入的同时加入免疫佐剂的基因, 使转基因植物在表达抗原蛋白的同时也表达免疫佐剂, 应是提高转基因植物口服疫苗免疫反应性的可行策略之一[1]。不耐热肠毒素(heat labile enterotoxin, LT) 是肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Ecoli, ETEC) 分泌的一种热不稳定性肠毒素, 由A、 B 两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白, 是目前人们发现的最强有力的黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂之一。动物免疫实验证实, LT全毒素分子明显比B亚单位五聚体有更强的免疫原性。研究发现, 单独的LTB与靶抗原同时口服后, 佐剂作用不明显, 而微量全毒素LT同抗原共同口服后, 表现出很强佐剂作用[2]。当前, 对减毒LT在烟草植物叶绿体中的表达已有研究[3], 但对大肠杆菌肠毒素LT在植物胞质中的表达还未见报道。本研究旨在从K88ac强致病菌株中克隆LTA、 LTB基因, 构建成双价植物高效表达载体, 最终通过转基因植物来研究其在植物胞质中组装成AB5六聚体的效率, 为进一步研究类LT全毒素传输疫苗载体打下了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 Ecoli DH5α菌株, pCAMBIA1302、 pCAMBIA2300、 pBI121及pBLG载体, 均为本实验室保存。限制性内切酶和T4 DNA连接酶为宝生物公司产品, Taq DNA聚合酶及pGMT Easy载体等为北京天为时代公司产品。
1.2 方法
1.2.1 LTA、LTB基因的克隆 采用碱裂解法从K88ac菌株中提取质粒。按照GenBank中的eltA(V00275)和eltB(M17874)的成熟肽LTA、 LTB基因序列, 采用Primer 50引物设计软件, 设计相应引物。引物由上海申工DNA合成部合成。扩增LTA基因的引物序列, P1为: 5′GGATCCATGCTCGAGAATGGCGACAGATTATAC3′, P2为: 5′GAGCTCTTATAATTCATCCCGGATTCTGT3′; 扩增LTB基因的引物序列, P3为: 5′CTCGAGATGAATAAAGTAAAATGTTATG3′, P4为: 5′GTCGACTTATAGTTCATCTTTGTTTTTCATACTGATTGC3′。为了方便构建植物表达载体, 在扩增LTA基因序列的上游5′端引物设计中, 引入了BamH I 酶切位点, 在下游5′端引入Sac I酶切位点, 并将LTA基因的终止密码子突变为（TGA→TAA）。同时, 按同义密码子将LTA基因末端的EcoR I酶切位点进行了A→G突变(见引物G)。在扩增LTB基因序列的上游5′端引物引入了Xho I酶切位点, 在下游5′端引入Sal I 酶切位点, 并将LTB基因的终止密码子进行突变（TAG→TAA）。扩增LTA及LTB基因的反应体系为: 10×buffer 2 μL、 25 mmol/L MgCl2 1 μL、 dNTP (25 mmol/L ) 02 μL、 上游引物 05 μL、 下游引物 05 μL、 DNA 模板 05 μL 、 Taq DNA 聚合酶 05 μL、 ddH2O 148 μL, 总体积为 20 μL。PCR 的反应程序为: 94℃ 5 min, 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共30个循环后再于72℃, 延伸7 min。 PCR产物的回收按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒产品的说明书进行; 目的基因与T载体的连接按pGMT 连接试剂盒和克隆试剂盒产品说明书进行。连接产物转化E.coli DH5α的感受态细胞, 通过蓝白斑筛选, 挑取阳性克隆提取质粒, 用BamH I/Sac I双酶切LTA/TVector, 用BamH I/Sal I双酶切LTB/TVector, 分别获得744 bp和375 bp的阳性克隆进一步作DNA序列测定(测序由上海生工测序部完成)。
1.2.2 LTA/pBI121、 LTB/pBLG植物表达载体构建 用BamH I/Sac I双酶切克隆载体LTA/TVector和载体pBI121, 分别回收目的基因条带和载体的大片段; 用T4 DNA 连接酶将回收的与载体的大片段连接。以连接产物转化E.coli DH5α的感受态细胞, 从培养的转化菌中中提取重组质粒并用BamH I/Sac I双酶切鉴定; 用BamH I/Sal I分别双酶切LTB/TVector和pBLG, 回收目的片段及载体片段, 用T4 DNA 连接按1∶3的比例连接载体与目的片段, 对获得的已转化的细菌进行菌落PCR筛选和酶切鉴定。
1.2.3 LTALTB/pCAMBIA2300植物双价表达载体构建 用EcoR I/Hind III分别双酶切LTB/pBLG和pCAMBIA2300, 分别回收目的片段和载体大片段, 将LTB基因与pCAMBIA2300酶切回收的大片段用T4 DNA连接酶连接, 构建LTB/pCAMBIA2300, 并进行酶切鉴定。设计接头Cla IEcoR IApa I, 同时用Cla I/Apa I双酶切LTA/pBI121, 回收大片段, 并将接头与大片段连接。再用EcoR I将表达框（启动子目的基因终止子）切下, 同时用EcoR I酶切LTB/pCAMBIA2300, 并用小牛小肠碱性磷酸酶使之去磷酸化, 将目的片段与之相连, 即获得LTALTB/pCAMBIA2300植物双价表达载体。
2 结果
2.1 LTA、 LTB基因PCR产物的电泳分析 在相同的PCR反应条件下, 经两次扩增, 琼脂糖凝胶电泳分析显示, 获得大小为744 bp 和375 bp 的 2个基因片段, 分别为LTA和LTB基因, 大小同预计结果一致(图1), 经克隆、 序列测定后, 进一步证实了所获得的两个基因片段是完全正确的。
图1 LTA/LTB基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 略
2.2 LTA/pBI121和LTB/pBLG植物表达载体的构建结果 植物表达载体pBI121中带有CaMV 35S启动子。将重组质粒LTA/pBI121经BamH I/Sac I双酶切, 并电泳分析（有大小约2300 bp的片段被切下）, 表明已获得植物表达载体pBI121LTA(图2)。pBLG起源于pBin438, 带有双CaMV 35S启动子和Ω增强子序列。用BamH I/Sal I双酶切LTB/pBLG, 电泳分析(有大小约1200 bp的片段被切下), 表明已获得植物表达载体PBLLTB（图2）。pCAMBIA2300中的TDNA区带有pUC18的多克隆位点。用EcoR I/Hind III将PBLGLTB表达框(D35SLTBnos终止子)直接克隆到pCAMBIA2300中, 即构建成pCAMBIA2300LTB单价植物表达载体。
图2 重组子pBILTA和pBILTB的限制性酶切鉴定 略
2.3 LTALTB/pCAMBIA2300植物双价表达载体的构建 经对LTA基因的序列分析, LTA基因内存在Hind III酶切位点, 不能直接利用载体中的EcoR I/Hind III酶切位点进行构建。故设计了接头Cla IEcoR IApa I, 同时用Cla I/Apa I双酶切pBI121LTA, 用接头进行替换。这样, 在植物基因表达框两边都带EcoR I酶切位点。再用EcoR I将目标片段（包括35S 启动子目的基因nos 终止子）切下, 同时用EcoR I酶切pCAMBIA2300LTB, 并将线性化的片段去磷酸化。将目的片段与之相连, 用Hind III 酶切鉴定的结果与预计的结果一致（Mr 约3000）, 即获得双价的pCAMBIA2300LTALTB植物表达载体（图3）。
图3 重组子pCABI2300LTALTB限制性酶切鉴定 略
3 讨论
利用转基因技术构建植物生物反应器, 生产口服疫苗是目前新兴的研究领域。与其他生产疫苗的方式相比, 转基因植物口服疫苗生产技术具有高效、 和简便等特点[4-6]。但植物口服疫苗一个缺点就是免疫效果不理想, 急需找到提高其免疫效果方法。加免疫佐剂是提高免疫原性的一种行之有效的方法。LTB是研究较多的一种黏膜佐剂, 但目前研究发现, 用完全失去毒性的LTB或CTB作为佐剂,易使机体对共服的抗原产生免疫耐受, 而且LTB与LT免疫调节机制也不完全一致[2]。因此用全毒素或减毒的全毒素作为免疫传递载体的效果可能更为理想。为此我们成功地克隆了LT的两个亚单位LTA 及LTB 基因。LTA及LTB分别由eltA和eltB基因控制, 二者首尾重叠4 bp, 由同一启动子操纵, 以共转录的方式合成mRNA, 通过对其表达的AB5多亚基蛋白胞内外装配过程的研究, 发现全毒素的装配过程在AB亚单位之间是高度协同的。A亚单位在全毒素的装配过程中起重要作用, A单位不能同已形成5聚体的B亚单位相互作用, 并且可提高B亚单位装配成全毒素的速率3倍[7]。要想使LT在植物中正确表达并有效组装, 必须使表达产物在同一细胞中积累。本研究将LTA 及LTB基因同时连接进载体pCAMBIA2300中, 构建植物双价表达载体pCAMBIA2300LTALTB, 为LT在同一细胞中的表达提供了必要的前提。增加表达量也是转基因植物疫苗达到广泛应用急需解决的问题之一, 常利用定位表达, 特异表达, 采用强启动子等方法来提高表达量, 有研究表明内质网滞留信号能有效的将H蛋白引导到内质网。据此我们,除了使用高效植物启动子CaMV 35S启动子外, 还分别在构建的双价LTB和LTA基因中引入了C端内质网滞留信号RDEL和KDEL核酸序列(引物加粗部分), 使表达产物能够定位于内质网, 以研究其组装成杂合六聚体的效率, 为进一步构建类全毒素传输疫苗载体打下基础[8]。总之本研究成功地构建高效表达的植物双价表达载体pCAMBIA2300LTALTB, 为转基因植物疫苗得到广泛的应用提供了提高免疫效果和高表达量的通用载体, 对植物口服疫苗的研制有重要的意义。
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