VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
作者：张晓, 徐文华, 葛银林, 侯琳, 李泉
【关键词】 RNA干扰;,小干扰RNA;,MCF
Effect of siRNA transfection targeting VEGF gene on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells
[Abstract] AIM: To explore the effect of RNA interferencemediated vascular endothelial growth factor (VEGF) gene silencing on proliferation and apoptosis of human breast cancer MCF7 cells. METHODS: Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF gene was designed and DNA template was synthesized, then siRNA was obtained by in vitro transcription. After dssiRNA was transfected into MCF7 cells with Lipofectamine, the proliferation of MCF7 cells was detected by MTT colorimetry, and the apoptosis was measured by Hoechst33258 staining. The change of cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM). The expression of VEGF on mRNA and protein level was analyzed by RTPCR and immunohistochemical technology respectively. RESULTS: The siRNA targeting human VEGF gene effectively inhibited the proliferation of MCF7 cells, induced cell apoptosis, arrested the cell cycle in G0/G1 phase, and decreased the expression of VEGF on both mRNA and protein level. But these effects did not appear in scrambled siRNA (siRNASCR) control group. CONCLUSION: The siRNA targeting human VEGF gene could reduce VEGF expression, inhibit cellular proliferation and induce apoptosis in MCF7 cells in vitro.
[Keywords]RNA interference; siRNA; MCF7 cell; VEGF; gene therapy
[摘 要] 目的: 探讨利用干扰RNA(RNAi)抑制血管内皮生长因子(VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF7增殖和凋亡的影响。方法: 设计针对VEGF基因的小干扰RNA (siRNA）, 合成DNA模板, 体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF7细胞后, 用MTT比色法检测siRNA对MCF7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变, RTPCR检测VEGF mRNA表达的变化, 免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果: 所设计的两个靶位点siRNA, 均能有效地抑制MCF7细胞的增殖, 诱导细胞凋亡, 使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGF mRNA及其蛋白的表达明显减少; 而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论: 体外转录合成的siRNA可抑制MCF7细胞中VEGF基因的表达, 抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。
[关键词]RNA干扰; 小干扰RNA; MCF7细胞; 血管内皮生长因子; 基因
将外源性或内源性双链RNA (dsRNA)导入细胞后, 可引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解, 其相应的基因也受到抑制, 这种发生在转录后的基因静寂(post transcriptional gene silencing, PTGS)现象[1, 2]被称之为RNA干扰(RNA interference, RNAi)。各种体内外实验证实, 21～23个碱基的短双链RNAsiRNA可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用, 并且比用核酶或反义RNA更有效、 更彻底。siRNA的干预效应具有高度的序列特异性, 任一碱基的错误均会导致RNAi效应的丧失[3]。20世纪70年代初, Folkman[4]首先提出“肿瘤生长和转移都依赖于新生血管的形成”的概念, 并得到大量实验结果的证实。目前发现, 能刺激细胞运动和肿瘤血管生成的因子有20多种, 其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是作用最强、 特异性最高的一种血管形成因子, 与肿瘤的发生、 关系密切。大量研究发现, VEGF在乳腺癌组织中高表达[5]。本实验中以VEGF基因为靶目标, 设计合成了siRNA, 通过脂质体将其转入乳腺癌细胞MCF7后, 研究了其“静寂”VEGF基因表达的效应, 为临床进一步应用提供了一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 MCF7乳腺癌细胞细胞株购自协和基础学院细胞中心。DMEM培养基、 LipofectamineTM2000及TRIzol Reagent购自Invitrogen公司。T7 RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒和反转录试剂盒购自Promega公司。四唑氮蓝（MTT）购自Sigma公司。Hoechst33258购自碧云天生物公司。SP法检测试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的制备 从GenBank中获得已知的人VEGF mRNA的序列(序列号: AB021221), 用Promega公司提供的设计软件和试剂盒设计合成siRNA的序列。错义序列组SCR的序列跟第2组siRNA的序列有相同的GC组成, 但与人的mRNA没有明显的同源性, 以此作为阴性对照[6]。体外转录出siRNA, 并分别标记为siRNA1、 siRNA2和siRNASCR。3种siRNA的序列分别为: 5′GAUCAAACCUCACCAAGGCUU3′(正义链), 5′GCCUUGGUGAGGUUUGAUCUU3′(反义链); 5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCUU3′(正义链), 5′GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU3′(反义链); 5′GCGUAACGCGGGAAUUUACUU3′(正义链), 5′GUAAAUUCCCGCGUUACGCUU3′(反义链)。
1.2.2 MCF7细胞增殖的MTT比色法检测 取对数生长期的MCF7细胞, 调整细胞的密度为6×107个/L加入到96孔板内, 每孔100 μL, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的培养箱中培养。培养24 h后弃去上清, 以脂质体包裹的siRNA转染细胞。设空白对照组（只加OptiMEM培养基）、 脂质体组（只加LipofectamineTM2000, 0.5 μL/孔）、 错义序列siRNASCR组、 siRNA1和siRNA2两组, 分别设立4个浓度梯度（终浓度均为100、 200、 400、 1000 nmol/L）, siRNASCR组只设1个浓度（200 nmol/L）。各组均加含各浓度的siRNA OptiMEM培养基100 μL, 先以无血清继续培养6 h后, 每孔补加新生牛血清10 μL, 继续培养。分别于24 h和48 h加入MTT 10 μL, 于37℃培养4 h后弃上清, 加入DMSO 100 μL, 震荡15 min, 用酶标仪读取A492值。细胞抑制率=(1－实验组的A值/空白对照组的A值)×100%。将各组所得的数据分别与脂质体对照组进行比较, 然后进行统计学分析。
1.2.3 MCF7细胞凋亡的检测 将siRNA1、 siRNA2和siRNASCR以200 nmol/L按上述方法转染48 h后, 收集细胞制备爬片, 加入多聚甲醛固定1 h, 去固定液, PBS洗3遍, 再加入10mg/L Hoechst33258(0.5mL/孔)避光染色10 min, 用封片液(500g/L PBS+500 mL/L甘油)封片后, 荧光显微镜观察。
1.2.4 siRNA转染后细胞周期的变化 将siRNA1、 siRNA2和siRNASCR 以200 nmol/L转染48 h后, 收集细胞, 经胰酶消化离心收集并重悬于PBS中, 用700 mL/L乙醇于4℃固定30 min。用含RNase及碘化丙锭(propidium iodide, PI)的染色液染色30 min后, 以流式细胞仪(EPICSELITEESP)进行细胞周期的分析, 每个样本检测约11000个细胞, 得出各期细胞数占细胞总数的百分率。
1.2.5 VEGF基因表达的RTPCR检测 将siRNA1、 siRNA2和siRNASCR 以200 nmol/L转染24 h后, 加胰酶消化离心收集细胞, 采用TRIzol试剂提取各组的总RNA, 进行RTPCR检测VEGF mRNA的水平。扩增VEGF基因上游引物的序列为: 5′CCTTGCTGCTCTACCTCC3′, 下游引物的序列为: 5′AAATGCTTTCTCCGCTCT3′, 扩增产物为421 bp。扩增内参照GAPDH（甘油醛3磷酸脱氢酶）基因上游引物的序列为: 5′ACTGCCACCCAGAAGACT3′, 下游引物的序列为: 5′GCTCAGTGTAGCCCAGGAT3′, 扩增产物为292 bp。cDNA的合成严格按Promega公司反转录试剂盒的说明书进行。以GAPDH基因为内参照, 于94℃变性30 s, 53℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 循环30次后, 于72℃延伸5 min。PTPCR产物以20 g/L的琼脂糖凝胶电泳后, 观察结果及照相, 并应用天能分析软件对电泳条带进行扫描, 检测各组VEGF mRNA RTPCR产物与其对应的内参GAPDH mRNA RTPCR产物的A值, 并将AVEGF/AGAPDH的比值进行统计学分析。
1.2.6 VEGF蛋白表达的SP免疫细胞化学染色检测 转染48 h后收集细胞, 制备细胞爬片, 经40 g/L多聚甲醛固定后, 按SP药盒的说明进行操作, 一抗为1∶50的抗VEGF抗体。在光学显微镜下观察结果, 细胞呈棕褐色或棕黄色者为阳性。用VIDAS图象分析系统,随机对每张玻片的3个视野中细胞的A值进行分析。
1.2.7 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件, 对上述检测的结果进行t检验和方差分析。
2 结果
2.1 siRNA对MCF7细胞增殖的影响 MTT比色法检测表明, 各浓度siRNA组与脂质体对照组相比较, 转染后MCF7细胞数明显减少, 细胞的形态发生变化（图1）。siRNA1、 siRNA2各浓度组与脂质体对照组的A值及对细胞增殖的抑制率, 在各时间点均有统计学意义(P<0.01); 错义序列siRNASCR组、 脂质体对照组与空白对照组相比较各时间点的结果无统计学差异(P>0.05, 表1)。在试验浓度范围内, siRNA1和siRNA2对MCF7细胞的抑制作用随着浓度的增加和作用时间的延长而增强, siRNA1的抑制作用更强。
图1 略
表1 转染siRNA后不同时间点MCF7增殖的MTT比色法检测 略
2.2 siRNA诱导MCF7细胞凋亡的作用 Hoechst33258 染色检测显示, siRNA组的细胞核出现凋亡的形态学改变, 表现为细胞核染色质高度聚集并裂解为碎块, 可见凋亡小体; 空白对照组、 脂质体对照组及错义序列组的细胞, 均没有出现上述形态学改变（图2）。
图2 略
2.3 转染siRNA后对MCF7细胞细胞周期的影响 流式细胞术检测显示, 转染组中G0/G1期细胞的比率升高, S期细胞的比率降低。错义序列组和脂质体对照组中, MCF7细胞的细胞周期未出现上述变化（图3）, 表明siRNA转染对MCF7细胞的增殖具有抑制作用, 与MTT比色法检测的结果相符。
图3 略
表2 转染siRNA后MCF7细胞的细胞周期变化 略
2.4 转染siRNA后各组MCF7细胞中VEGF mRNA的表达 琼脂糖凝胶电泳显示, 空白对照组、 脂质体对照组及错义序列组的样本于421 bp处均可见清晰的条带, 而siRNA各组的条带均明显减弱(图4)。各组相应的内参照GAPDH的条带一致。运用天能分析软件, 对各条带进行扫描后, 转染siRNA1、 siRNA2后, MCF7细胞中VEGF mRNA的表达量分别减了51%和42%。
图4 转染siRNA后MCF7细胞中VEGF mRNA的表达 略
2.5 转染siRNA后各组MCF7细胞中VEGF蛋白的表达 免疫组化染色检测显示, 各组MCF7细胞中均有VEGF蛋白的表达, 表达阳性的颗粒呈棕黄色, 位于细胞质中。转染siRNA的MCF7细胞中VEGF蛋白的表达明显减少（图5）。VIDAS图象分析表明, siRNA1组、 siRNA2组、 siRNASCR组、 脂质体对照组和空白对照组的A值, 分别为0.192±0.012、
图5 siRNA转染后MCF7 细胞中VEGF蛋白表达的免疫组化（SP法）染色检测 略
3 讨论
抑制血管的生成已成为近年来抗肿瘤研究的重要课题和热点问题。肿瘤血管的形成受多种因子的调节, 其中最重要的是VEGF。VEGF不仅可作为促血管生成因子和血管通透性因子, 通过旁分泌促进局部新生血管的生成而支持瘤细胞的生长, 还可通过自分泌影响瘤细胞的凋亡、 浸润转移能力, 以及宿主的免疫功能等促进肿瘤的增长与[7]。对VEGF基因mRNA的不同剪接可产生5种异构体（即VEGF121、 145、 165、 189及206[7]）, 其中VEGF165是最为常见的形式, 在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中均有表达[5, 8], 在肿瘤微血管生成过程中扮演重要角色。由于VEGF的表达水平与肿瘤的生长、 转移、 疾病的复发和患者的预后密切相关, 因此, 抑制VEGF的表达阻止或减少肿瘤中微血管的形成, 将成为治疗肿瘤的一个新策略[9, 10]。RNAi技术为干预基因表达的理想方法, 其可从基因水平上抑制VEGF基因的表达, 减低甚至阻止VEGF的分泌, 而且其作用特异、 高效、 毒性小, 可作为的肿瘤基因治疗理想方法[11]。若将siRNA1与siRNA2联合应用, 抗肿瘤的效果可能更加明显。研究中我们利用分子生物学技术, 设计、 体外转录了针对VEGF基因的两组siRNA。将二者转染人乳腺癌细胞系MCF7后, 结果显示, 所设计的两个靶位点siRNA均能有效地抑制乳腺癌细胞的生长, 表现为诱导细胞凋亡, 使细胞停滞于G0/G1期, VEGF mRNA及其VEGF蛋白的表达水平也显著降低; 而作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有上述作用。结果表明, RNA干扰技术为肿瘤的基因治疗提供了新思路。值得提及的是, siRNA并不能完全阻止使MCF7细胞表达VEGF, 而且肿瘤血管的形成受多种细胞因子的调节, 单一抑制VEGF的表达并不能达到完全抑制肿瘤血管形成的目的, 要达到更好的抑制效果, 还必须联合使用多种方法进行综合治疗。
:
[1] Fire A. RNAtriggered gene silencing[J]. Trend Genet, 1999, 15(9): 358-363.
[2] Fire A. Potent and genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 1998, 391: 806-811.
[3] Brummelkamp TR. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science, 2002, 296(5567): 550-553.
[4] Folkman J . Tumor angiogenesis: theropeutic implications[J]. N Engl J Med, 1971, 285 (21): 1182 -1186.
[5] Chung J, Yoon S, Datta K, et al. Hypoxiainduced vascular endothelial growth factor transcription and protection from apoptosis are dependent on alpha6beta1 integrin in breast carcinoma cells[J]. Cancer Res, 2004, 64 (14): 4711-4716.
[6] Takei Y, Kadomatsu K, Yuzawa Y, et al. A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics[J]. Cancer Res, 2004, 64(10): 3365-3370.
[7] 杨 英. 血管内皮生长因子在肿瘤中的作用[J]. 国外医学・肿瘤学分册, 2004, 12(31): 18-20.
[8] 于 铭, 钱蕴秋, 禄韶英, 等. VEGF真核表达载体的构建及在内皮与心肌内的表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2003, 19(3): 223-224.
[9] Kollermann J, Helpap B. Expression of vascular endothelial growth factor and VEGF receptor Flk1 in benign, premalignant and malignant prostate tissue[J]. Am J Clin Pathol, 2001, 116(1): 115-121.
[10] 谷仲平, 王云杰, 周勇安, 等. VEGF165反义RNA对食管癌细胞影响的实验研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(2): 199-202.
[11] 汪光蓉. RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展[J]. 四川生理杂志, 2005, 27(1): 20-23.
