癌症高表达蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义
作者：张鹏 李卫华, 杨涛, 党军强, 陈勇
【关键词】 ,癌症高表达蛋白;,肝细胞肝癌;,细胞周期
[摘 要] 目的: 研究癌症高表达蛋白(Hec1)在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达和意义。方法: 采用免疫组化SP 法检测27例正常肝组织、 30例癌旁组织及62例HCC组织中Hec1的表达; 用Western blot检测上述组织中Hec1蛋白的表达。结果: 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白的阳性表达率分别为0%、 20.8%、 62.9%, 各组织中Hec1蛋白的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、 侵袭转移显著相关。Western blot结果表明, 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白的平均表达量的分别为0、 0.12±0.03、 0.89±0.16, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论: Hec1蛋白的过度表达可能在HCC的发生和中起重要作用。
[关键词] 癌症高表达蛋白; 肝细胞肝癌; 细胞周期
原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见肿瘤之一, 在我国该病的发病率有上升趋势。癌症高表达蛋白(highlyexpressedincancer, Hec1)最初是通过酵母双杂交方法发现的, 由于在癌症中表达高于正常组织而被命名。Hec1蛋白属于细胞周期蛋白, 在终末分化的细胞中不表达, 在所有分裂旺盛的细胞中表达量高。我们应用免疫组化和Western blot技术检测Hec1蛋白在HCC组织的表达, 探讨Hec1蛋白与HCC侵袭和转移的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 收集2005-04～2006-06第四军医大学西京手术切除的HCC标本62 例。年龄32～76（平均56）岁。按照Edmondson分级标准Ⅰ～Ⅱ级为高分化癌20 例, Ⅲ～Ⅳ级为低分化癌42 例。患者肝功能按Child 分级, A 级35 例, B 级27 例。直径≤5 cm的肿瘤24 例, 直径>5 cm的肿瘤38例。HCC侵袭转移条件为: ①肝门淋巴结转移; ②肝内肿瘤数目≥2 个; ③门静脉癌栓形成; ④癌周多个卫星结节形成; ⑤癌组织浸润破坏肿瘤包膜。凡符合上述条件中的1 项以上者定为有转移倾向组, 共41例, 凡不符合上述5 项条件者为无转移倾向组, 共21 例。癌旁组织标本24 例。20例正常肝组织取自肝血管瘤手术切除标本作为对照组。手术中取材后均分成2 份: 1 份经100 mL/L甲醛固定, 石蜡包埋, 连续4 μm切片; 1份置液氮速冻后于-70℃低温冰箱保存。所有标本均经病理组织学检查证实。鼠抗人Hec1单克隆抗体(mAb)为科技大学生命院姚雪彪教授提供, 羊抗鼠(二抗)、 SP试剂盒购自北京中山公司。ECL发光液为Pierce公司产品。GAPDH(抗3磷酸甘油醛脱氢酶, mAb)标准内参照为上海康成生物公司产品。Triton X100、 二硫苏糖醇(DTT)、 PMSF、 Aprotinin为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化染色 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)免疫组织化学方法, 具体操作按试剂说明书进行。以微波枸橼酸盐进行抗原修复, DAB显色, 同时用PBS代替一抗作阴性对照, 用预实验中已知的Hec1表达阳性片作阳性对照。结果判断: Hec1以细胞核染成淡黄或棕黄色为阳性, 在400倍光镜下观察20个视野, 每个视野计数200个细胞, 阳性细胞数记分: <5%为0分, 5%～25%为1分, 26%～50%为2分, 51%～75%为3分, >75%为4分; 染色强度记分: 淡黄色为1分, 黄色为2分, 棕黄色为3分; 组织化学积分(两记分的乘积): >1为阳性, ≤1为阴性。
1.2.2 Western blot检测 按1∶5（质量/体积）的比例加入组织裂解液, 含7 mmol/L尿素, 20 mL/L Triton X100, 40 mmol/L TrisHC1, pH8.0, 100mg/L PMSF, 1mg/L Aprotinin, 40mmol/L DTT和去离子水, 置于冰上, 将组织碾碎后放置1.5～2.0 h, 匀浆器匀浆; 4℃,12000 r/min离心20 min, 取上清匀浆用Bradford法测定上清液中总蛋白的浓度, 分装于-70℃冰箱备用。将总蛋白煮沸变性10 min, 以50 μg/孔上样, 在120 g/L的SDSPAGE 凝胶中进行电泳分离, 电泳完毕后, 通过电转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至PVDF膜。TBST洗涤后PVDF膜在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中37℃封闭90 min, 加入一抗(鼠抗人Hec1抗体, 稀释度1∶1000)4℃孵育过夜, TBST 充分漂洗(10 min×3次), 加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG, 稀释度1∶1000) 37℃作用1 h, TBST 充分漂洗(10 min×3次)后, 化学荧光法(ECL)显色, 结果用凝胶成像仪扫描, 用软件分析。以待测蛋白Hec1条带与内参照GAPDH 条带灰度值的比值作为指标。
1.2.3 统计学处理 采用SPSS10.0 软件对数据资料进行分析。组间率的比较采用χ2检验, Fisher确切概率法。Western blot结果比较采用单因素方差分析。
2 结果
免疫组化结果显示,正常肝组织中Hec1蛋白未见表达, 癌旁组织中Hec1蛋白表达阳性率为20.8%（5/24）, HCC组织中Hec1蛋白表达阳性率为62.9%（39/62）, 各组织中Hec1蛋白的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、 侵袭转移显著相关（图1、 表1）。
图1 Hec1 的表达 略
表1 Hec1表达与临床病理特征的关系 略
Western blot检测组织中Hec1蛋白表达结果显示在Mr72000处有一条特异性条带, 与Hec1的分子量相符, 表明有Hec1蛋白的表达。正常肝组织中Hec1蛋白无表达; 癌旁组织中Hec1蛋白平均表达量的灰度值为0.12±0.03; HCC组织为0.89±0.16（图2)。HCC组织中Hec1蛋白表达水平明显高于正常肝组织和癌旁组织, 差异有统计学意义(P<0.05)。
图2 Western blot分析Hec1蛋白的表达 略
3 讨论
Hec1蛋白为一种富卷曲螺旋结构的核蛋白, 由人hec基因编码, 由642个氨基酸组成, Mr为72000。Hec1 mRNA在有丝分裂期明显增多, 且在S到M期升高尤为明显。细胞周期检查点(mitotic checkpoint)是保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制。是真核细胞维持基因组完整性并使致肿瘤倾向最小化的机制之一。在哺乳动物细胞中, 检查点的缺失或检查点功能的损伤可以导致染色体的不稳定和癌症的发生。在一些癌细胞中检查点功能的丧失被认为与它们抗肿瘤（如化疗和放疗）的敏感性有关。研究表明, Hec1具有召集Mad1/Mad2和Mps1复合物结合到着丝粒上的作用[1, 2], 这种结合可以激活纺锤体组装检查点途径中非常重要的APCCdc20 途径[3]。通过RNAi方法使Nuf2和Hec1基因沉默后发现这两种蛋白是Mad1和Mad2结合与固定在着丝点所必需的[4]。Hec1失活导致严重且致死的有丝分裂进程的瓦解[3, 5]。本研究显示, Hec1蛋白在HCC中的表达率为62.9%, 癌旁组织表达率为20.8%, 正常组织未见阳性表达。阳性表达差异具有统计学意义。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、 侵袭转移显著相关相关, 与年龄、 肿块直径、 肝功Child分级无关。Western blot结果表明, 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白平均表达量之间的差异有统计学意义(P<0.05)。提示Hec1可能参与肿瘤增殖的发生、 过程。siRNA处理后的癌细胞可出现明显的调亡[6, 7], 但是很少实验动物体内的肿瘤能被根除。Gurzov等[8]在研究中发现在人恶性胶质瘤和腺癌细胞系中RNAi 能有效的使Hec1下调至致死水平, 同时在RNAi治疗后多倍体的肿瘤细胞增多, 并且这些细胞出现了细胞周期变长和有丝分裂发生率变小的倾向。
Hec1被有效地抑制后, 在裸鼠形成肿瘤的能力也受到了影响。Hec1对细胞致死性的影响可能是由于有丝分裂突变诱导的和遗传不稳定性造成的, 这些结果表明Hec1敲除可以被用来作为阻断细胞分裂的一种新的方法, 并能起到抑癌作用。Hec1基因可能在HCC的发生发展过程中起重要作用, 对HCC的诊断及预后有重要的价值。对Hec1作用机制的进一步阐明, 可为以Hec1为靶向的HCC的基因治疗提供理论依据。
参考:
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[3] Gardner RD, Burke DJ. The spindle checkpoint: two transitions, two pathways[J]. Trends Cell Biol, 2000, 10(4): 154-158.
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[8] Gurzov EN, Izquierdo M. RNA interference against Hec1 inhibits tumor growth in vivo[J]. Gene Therapy, 2006, 13(1): 1-7.
