大青叶对IL

                   作者：董军  裘晟 谢新华  潘锐  唐红梅, 陆大祥

【关键词】  大青叶;,IL

　　Effect of daqingye on EP3 mRNA expression of  hypothalamus in IL1βinduced rabbits

　　[Abstract]  AIM: To study the antipyretic effect and  mechanism of Daqingye injection (DQYI). METHODS: The IL1βinduced febrile New Zealand rabbits were chosen as experimental models and the antipyretic effect of DQYI was observed. The expression of EP3 mRNA was investigated by using in situ hybridization (ISH) in POAH. RESULTS: First, the colonic temperature went up gradually after intravenous(i.v) IL1β. The peak value of temperature(△T) and thermal response index (TRI1) in IL1βtreated group were higher than those in control group (P<0.01). The △T and TRI1 of in  DQYI  and IL1β treated group were lower than those in IL1βtreated group (P<0.05). The temperature of DQYItreated group showed no distinguished difference compared with that in control group (P>0.05). Second, the expression of EP3 mRNA in the POAH of IL 1βtreated group increased markedly compared with that in control group (P<0.01). The expression of EP3 mRNA treated by IL1β+DQYI in the POAH decreased strikingly compared with that in IL1β group(P<0.05). CONCLUSION: DQYI  has distinct  antipyretic effect on IL1βinduced fever. The mechanism might be the inhibition of EP3 mRNA expression in POAH from rabbits.

　　[Keywords]daqingye; IL1β; antipyretic; preoptic anterior hypothalamus(POAH); Etype prostaglandin receptor

　　[摘 要]  目的: 阐明大青叶的中枢解热机制, 为其临床应用提供实验依据和理论指导。方法: 实验用新西兰兔复制白介素1β(interleukin1β, IL1β)发热模型, 在观察大青叶注射液(Daqingye injection, DQYI)解热作用的基础上, 应用原位杂交技术检测静脉注射DQYI 对IL1β作用下新西兰兔视前区下丘脑前部(preoptic anterior hypothalamus, POAH)组织中前列腺素E3受体（Etype prostaglandin receptor, EP3） mRNA表达的影响。结果: （1） DQYI静脉注射后对正常新西兰兔结肠温度没有明显影响, 与生理盐水组相比, 最大体温上升高度(△T)及1 h体温反应指数(TRI1) 两组间无统计学意义(P>0.05); IL1β组在静脉注射IL1β后, 结肠温度逐渐升高,  △T及TRI1与生理盐水组相比, 也有统计学意义(P<0.01); 而DQYI+IL1β组结肠温度上升峰值明显低于IL1β组, 两组△T及TRI1比较, 有显著性差异(P<0.05)。（2）新西兰兔下丘脑 POAH EP3 mRNA在生理状态下仅有少量或没有表达; IL1β诱导发热后, EP3  mRNA表达明显增强; 而DQYI 能减少IL1β作用下EP3  mRNA的表达(P<0.05)。结论: DQYI对IL1β诱导的新西兰兔发热有解热作用; 且其解热作用机制可能与其抑制下丘脑EP3  mRNA的表达有关。

　　[关键词]大青叶; IL1β; 解热; POAH; 前列腺素E受体
   
　　发热是指由于致热原的作用, 使体温调节中枢的调定点上移而引起的调节性体温升高（超过05℃）。临床各种原因引起的过高的发热（>40℃）都会促进疾病的发生并威胁生命。因此, 维持哺乳动物体温的相对恒定, 是机体进行新陈代谢和正常生命活动的必要条件, 及时解热尤其重要。目前临床西药疗效肯定, 但存在较多副作用, 而中药既具有很好的抗炎解热作用, 且毒副作用小。因此, 对清热解毒类中药的抗炎解热作用机制研究很有必要。大青叶是重要的清热解毒中药, 有较强的抗甲型流感病毒、 抗内毒素及免疫增强作用, 并能广谱抗菌[1]。以大青叶为主的复方制剂解热的临床观察和药效学研究也较多, 但对大青叶是通过何种途径起解热作用, 其作用靶点和机制究竟如何, 至今国内外少见报道。因此, 我们采用IL1β复制新西兰兔发热模型, 在观察大青叶注射液（daqingye injection, DQYI)解热作用的基础上, 运用原位杂交技术来检测静脉注射DQYI后对IL1β作用下新西兰兔下丘脑组织中EP3 mRNA表达的影响, 以阐明DQYI的中枢解热机制, 为临床应用提供实验依据和理论指导。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要设备及试剂  ST1型数字温度计（上海医用仪表厂）, 电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）, CM1900型恒冷箱切片机（德国徕卡公司）, DMRA2正立电动荧光显微镜（德国徕卡公司）, Leica Qwin彩色图像分析系统（德国徕卡公司）, IL1β（美国Sigma公司）, 大青叶注射液(山东鲁南制药厂), 原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

　　1.2  实验动物及分组  健康新西兰兔24只, 雌雄不限, 质量1.5～2.0  kg, 随机分成4组, 每组6只。(1)生理盐水(NS)对照组: 每只动物静脉注射NS 1 mL; (2)大青叶注射液(DQYI)组: 每只动物静脉注射DQYI 1 mL; (3)白介素1β组: 每只动物静脉注射IL1β 100 ng（用无热原NS稀释至1 mL）; （4）DQYI加IL1β组: 静脉注射DQYI 1 mL/只, 30 min后再静脉注射IL1β（剂量同IL1β组）。

　　1.3  发热动物模型的制备  使用ST1型数字温度计（使用前用标准温度计校正）测量结肠温度。实验前3 d将兔置于实验环境中模拟操作以适应实验条件, 每天4～6 h, 第4天正式实验。实验时, 实验室温度保持在23±1℃, 将新西兰兔置于特制兔箱中, 用涂有石蜡油的测温探头经肛门插入10 cm, 并用胶布固定于尾根部, 待体温稳定后, 每隔10 min记录1次结肠温度, 取3次的平均值作为基础体温。IL1β组从耳缘静脉注射IL1β, 并每隔10 min记录体温1次, 共记录70 min; NS对照组从耳缘静脉注射NS。各实验组记录体温方式相同。

　　1.4  取材和切片  记录至70 min时, 用200 mL/L氨基甲酸乙酯进行麻醉, 迅速分离双侧颈总动脉和一侧颈外静脉, 其中一侧颈总动脉插管, 另一侧颈总动脉结扎, 开放颈外静脉,  快速(2 min内)输入37℃ 1 g/L肝素焦碳酸二乙酯（DEPC ）水100 mL, 再先快后慢灌注4 ℃ 40 g/L多聚甲醛200 mL, 维持灌注30 min; 取兔脑, 放入40 g/L多聚甲醛后固定, 置于4 ℃冰箱保存4 h。再置入200 g/L蔗糖溶液中过夜, 次日作冰冻切片。切片厚度为10 μm, 隔二取一, 于37℃干燥4～10 h后进行原位杂交。

　　1.5  下丘脑EP3 mRNA原位杂交  随机选取每只动物下丘脑前部5张切片行原位杂交检测EP3 mRNA, 杂交过程参见试剂盒说明。主要步骤为: 300 mL/L H202 10 min, 30 mL/L柠檬酸稀释的胃蛋白酶10 min, 0.1 mol/L PBS洗后加预杂交液40℃ 3 h, 加杂交液(含EP3寡核苷酸探针)40℃过夜, SSC洗涤后加封闭液37℃ 30 min, 加生物素化鼠抗地高辛37℃ 1 h, 0.1 mol/L PBS洗后加SABC 37℃ 20 min, PBS洗后加生物素化过氧化物酶37℃ 20 min, PBS洗后DAB显色5 min, 常规脱水透明封片。阴性对照做如下设置: (1)加含探针的杂交液前, 切片先用RnaseA预处理(37℃, 30 min); (2)在杂交时, 以不含探针的杂交液进行杂交。原位杂交探针为寡核苷酸探针, 序列为:(1)5′ TCTGCACCCGCCTCAACCACTCGTATCCAGGCATG 3′(2)5′TGTCGCGTAGCTACCGGCGTCGGGAGAGCAAGCGC3′(3)5′TGCAC CTTCTTTGGTCTGAC CATGACTGTTTTCGG 3′由武汉博士德生物工程有限公司提供, 并用地高辛标记探针5′端。

　　1.6  图像分析  每只动物选片5张, 以细胞胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性染色, 并对POAH阳性细胞进行记数; 每张切片取3个视野, 平均值。采用Leica Qwin彩色图像分析系统, 分别测出下丘脑的平均灰度值。

　　1.7  统计学分析  所有实验数据均以均数±标准差（ x±s）表示, 用SPSS11.0进行t检验。

　　2  结果

　　2.1  大青叶注射液对IL1β性发热效应的影响  分别静脉注射DQYI和NS对两组新西兰兔体温没有明显的变化, 两组比较△T及TRI1均无明显差异(P>005); 而IL1β组在注射IL1β后, 结肠温度逐渐升高, 与NS组相比, △T及TRI1有显著性差异(P<001); DQYI+IL1β组在事先注射DQYI后, 温度上升峰值明显低于IL1β组, 两组△T及TRI1相比较具有统计学差异(P<0.05, 图1)。

　　图1  大青叶注射液对IL1β性发热的影响　略

　　表1  大青叶注射液对IL1β性发热的影响　略

　　2.2  大青叶注射液对发热新西兰兔POAH EP3 mRNA表达的影响  EP3 mRNA原位杂交阳性信号呈棕黄色颗粒, 分布于胞质和近端突起中。NS组和DQYI组EP3 mRNA原位杂交呈阴性(不显色)或弱阳性(胞质中仅见少量淡棕黄色颗粒, 细胞不可辨识)(图2A、 B), 阳性细胞数、 平均灰度值两组间均无统计学差异(P>0.05)(表2); IL1β组EP3 mRNA表达明显增强, 阳性细胞数显著高于NS组(P<0.01)(图2C), 平均灰度值低于NS组（P<0.01）; 而DQYI能抑制IL1β诱导的EP3 mRNA表达, IL1β+DQYI组的阳性细胞数低于IL1β组（P<0.05）, 其平均灰度值高于IL1β组（P<0.05）（表2, 图2D)。

　　表2  EP3mRNA原位杂交阳性细胞数及平均灰度值变化　略

　　图2  各组POAH EP3 mRNA原位杂交染色　略

　　3  讨论

　　在发热研究中可采用多种动物模型, 如细菌或细菌产物、 无菌性炎症、 化学药物、 暴露于高热环境及刺激下丘脑体温调节中枢等。虽然大多数发热模型都是通过内生致热原导致下丘脑体温调节中枢调定点上移, 从而使机体产热增加、 散热减少, 体温升高, 但不同的外源性致热原在起始阶段的作用途径不同, 加之药研究要求致热刺激的强度应尽可能稳定并易于控制, 所以应根据研究目的和条件选择致热方法。发热实验的动物选择中, 小鼠、 豚鼠恒温功能差, 不宜用于复制发热模型; 新西兰兔体温恒定, 发热反应典型而稳定, 敏感性和重复性甚佳。因此内毒素性或内生致热原性发热新西兰兔模型最为常用。在药物解热实验中, 给药时间的选择可以在致热前或致热后, 采用中药解热作用的实验研究常选择在致热前给予受试药物。本实验室[2, 3]曾多次使用新西兰兔IL1β性发热模型, 已熟练掌握了其相应的实验方法, 故本实验也选用该模型来研究DQYI的解热作用及其作用机制。在本次实验中, 给新西兰兔静脉注射IL1β 100 ng/只后, 体温逐渐上升, 约60 min到达发热高峰, 最高可达11℃; 而预先给予大青叶注射液, 30 min后再注射IL1β的新西兰兔, 其发热高峰和发热时程均明显减低; 而大青叶注射液对正常新西兰兔的体温没有明显影响。以上结果表明: 大青叶注射液对IL1β诱导的新西兰兔发热有解热作用。根据目前的发热理论, 要想取得解热效果, 只要打断发热的某个或某些环节即可。中药解热作用机制的研究结果也同样遵循这一。目前认为药物解热作用的机制包括: 直接作用于体温调节中枢、 抑制内生致热原产生、 抑制下丘脑组织前列腺素E2（PGE2）的合成、 降低下丘脑组织内环磷酸腺苷（cAMP）含量、 降低Na+/Ca2+比值, 增加精氨酸加压素（AVP）、 促黑细胞刺激素的合成, 舒张皮肤血管以及兴奋汗腺促进体内热扩散等。IL1β是参与多种致热原性发热的重要细胞因子[4], IL1β结合到靶细胞(如巨噬细胞、 内皮细胞、 小胶质细胞等)的白介素1受体（IL1R）时, 其构象发生改变, IL1R即与胞浆内IL1I受体辅助蛋白(IL 1RacP)结合, 该复合物吸引并激活髓样细胞分化因子(myeloid differentiation factor, MyD88), 通过Toll样受体信号转导途径促进细胞因子（IL1β、 IL1α、 IL6、 TNF、 IL10等）的表达[5-7], 进而调节发热反应。PGE2是多种致热原诱导发热的重要中枢介质, 中枢PGE2主要通过与其受体结合引起一系列与发热有关的细胞功能变化。PGE2受体有4种亚型: EP1、 EP2、 EP3、 EP4, 其中EP2、 EP4与G蛋白亚基Gs偶联, 可引起胞内cAMP水平升高; EP1与G蛋白亚基Gq偶联后可升高胞浆Ca2+浓度; EP3可与蛋白亚基Gq、 Gi和Gs偶联,   胞内主要效应表现为Ca2+、 IP3升高和cAMP升高。多数学者认为EP3是介导发热的主要受体。EP3主要分布在下丘脑的内侧视前区（MPO）和正中视前区（MnPO）[8]。IL1β能刺激多种细胞的花生四烯酸代谢, 使PGE2合成增多。Pierro等[9]实验证明外周生成的IL1β能促进脑血管内皮细胞合成PGE2; 王达安等[10]采用体外下丘脑组织培养法观察到IL1β能使下丘脑PGE2 cAMP含量明显升高。故推测IL1β有促进下丘脑组织释放cAMP的作用。由此IL1β引起发热的可能机制之一是: IL1β与终板血管器（organum vasculosm laminae terminalis, OVLT）处血管内皮细胞及其周围的巨噬细胞的IL1R结合, 促进靶细胞内PGE2合成, 并以旁分泌形式诱导并结合于下丘脑温度敏感神经元的PGE2受体, 促进cAMP的合成。因此, 本课题从这一环节入手, 在了解大青叶解热作用的效应后, 利用ISH技术, 观察了大青叶注射液对兔下丘脑中POAH EP3 mRNA 表达的影响。我们的实验结果表明, IL1β能使POAH EP3 mRNA表达增加, 而大青叶注射液能抑制IL1β诱导的EP3 mRNA表达。提示其解热作用可能与抑制EP3 mRNA的表达有关。

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