构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab

            作者：王臣  侯利华 杜桂鑫 李建明 陈溥言  童贻刚

【关键词】  噬菌体抗体库;,,整合素ανβ3;,人源化Fab

　　［Abstract］  AIM: To construct phage antibody library with predetermined CDR3 and to screen humanized Fab of  antihuman integrin ανβ3   monoclonal antibody (mAb) by epitope guided selection. METHODS: LCDR3 gene of mAb E10 was inserted into human light chain variable region gene library. Hybrid phage antibody library was constructed by cloning E10 chimeric Fd gene and human light chain variable region gene into pComb3. Humanized light chain gene was obtained by screening against human integrin ανβ3. Likewise,   humanized Fab were gained by panning human phage antibody library,  which was constructed by cloning humanized light chain gene  and  human heavy chain Fd gene with E10 HCDR3 into pComb3. RESULTS: Three humanized Fab clones was obtained by screening hybrid phage antibody library and human phage antibody library, which contained 2.1×106, 2×107 colony forming units, respectively. Indirect ELISA and competitive inhibition ELISA analysis demonstrated that three humanized Fab antibody had specific binding activity with human integrin ανβ3. The strongest antihuman integrin ανβ3  reactive D5 clone was sequenced and sequencing analysis showed that the Vκ and VH were derived from VKIII and VHI,  respectively. CONCLUSION: Humanized Fab of antihuman integrin ανβ3  mAb has been successfully obtained by phage display technology which lays the foundation for further clinical research.

　　［Keywords］phage antibody library;  integrin ανβ3; humanized Fab

　　［摘  要］  目的: 构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,  通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法: 将鼠mAb LCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,  用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAb HCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,  筛选人源化Fab。结果: 分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,  筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,  能特异结合整合素ανβ3抗原, 其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,  人轻链可变区基因属VKIII亚群,  人重链可变区基因属VH1亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术,  成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3  mAb E10人源化的改造,  为进一步临床应用奠定了基础。

　　［关键词］噬菌体抗体库;  整合素ανβ3; 人源化Fab
   
　　鼠源单克隆抗体(mAb)为人类疾病的研究起到了重大的推动作用,  但由于其应用于人体易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,  严重限制了其临床应用。噬菌体抗体库技术作为抗体技术领域中的一项革命性进展,  该技术自建立之日起就得到了广泛应用。目前也被公认是制备抗体的高效技术平台［1, 2］。同时该技术也为鼠mAb的人源化提供了新的方法。Jespers等［3］报道的抗原表位导向选择法的优越性,  在于其可获得和原来鼠mAb针对同一表位的完全人源抗体。王卓智等［4］曾运用该方法对抗TNFα鼠mAb进行人源化,  但所获人源mAb的特异性和亲和力难以得到保证,  在实验中常常难以获得满意的人源抗体。Rader等［5］利用上述抗原表位导向选择法构建了预设的抗体库,  经对抗整合素ανβ3鼠mAb LM609进行人源化改造,  取得了良好的效果。即先用鼠Fd片段基因与含有鼠mAb LCDR3的人轻链基因配对构建杂合噬菌体抗体库,  筛选人源化轻链。然后再用筛到的人源化轻链与含有鼠mAb HCDR3的人Fd基因配对构建人源抗体库,  筛选人源mAb基因。该方法对人抗体可变区基因文库进行了预设,  将原鼠mAb的CDR3基因预先重组到人可变区文库中。由于可变区的CDR3是决定抗体特异性的关键部位,  因而使可变区文库中模拟亲本鼠mAb的能力大大提高,  并易与筛到可与亲本鼠mAb形成理想配对的人可变区基因。本研究中,  我们利用抗原表位导向选择方法,  对1株抗人整合素ανβ3鼠mAb E10进行了人源化改造,  成功地筛选到3株人源化Fab片段。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  噬菌粒pComb3、 大肠杆菌XLIBlue及辅助噬菌体VCSM13, 均为本室保存。含人源抗HBsAg抗体轻、 重链全长基因的双表达质粒B4HFLF为本室构建。抗人整合素ανβ3杂交瘤细胞株E10及抗人整合素ανβ3鼠mAb（效价1∶2 000）由军事医学院基础医学研究所孙启鸿研究员惠赠。抗人整合素ανβ3单链抗体(scFv)和鼠人嵌合Fab噬菌体抗体由本室构建和表达［6, 7］。人整合素ανβ3蛋白购自美国Chimcon公司。HRP标记的抗VCSM13 mAb及淋巴细胞分离液FicollPaqueTM PLUS,  购自Amersham Pharmacia公司。人脐带静脉血取自解放军301。

　　1.2  方法

　　1.2.1  RNA提取及PCR扩增  取人胎盘脐带静脉血100 mL, 用淋巴细胞分离液FicollPaqueTM PLUS分离人淋巴细胞,  并按TRIzol Regent试剂盒的说明书提取细胞总RNA,  依试剂盒制备cDNA。引物参照［5, 8］设计,  稍作改动。具体引物序列可参阅文献［9］。PCR扩增人抗体VH及VL FR1FR3基因的条件为:  94℃变性15 s,  52℃退火20 s, 72℃延伸60 s,  共30个循环。

　　1.2.2  含鼠mAb CDR3的人轻链和Fd基因库的构建  以B4HFLF载体为模板,  用引物CR501及CR301扩增人VHFR3鼠HCDR3人VHFR4CH1基因片段。分别以引物CκR5、  CλR5与CκR3配对,  扩增人Vκ FR3鼠LCDR3人Vκ FR4Cκ和人VλFR3鼠LCDR3人Vκ FR4Cκ基因。将所获基因片段,  分别与上述PCR扩增的各种组合人抗体VH及VL FR1FR3基因逐个配对相互融合。重链Fd基因融合的PCR条件为:  取人VHFR3鼠HCDR3人VHFR4CH1基因及人抗体VHFR1FR3基因各15 ng为模板,  分别以VH sense primers和CR301为引物于94℃变性20 s,  55℃退火20 s,  72℃延伸60 s,  共25个循环。分别将各种引物组合所扩增的融合PCR产物混在一起即为构建的含鼠HCDR3的人重链Fd基因库。轻链融合条件同上类似于扩增κ链及λ链的PCR产物,  混合后即为构建的含鼠mAb LCDR3的人轻链基因库。具体操作过程可参照文献［9］。

　　1.2.3  噬菌体抗体库的构建及鉴定  本研究分别要构建鼠人嵌合Fd人轻链杂合噬菌体抗体库及人源噬菌体抗体库。杂合抗体库的构建:  将鼠人嵌合Fd基因和人轻链基因库分别经Xho I/Spe I、 Sac I/Xba I双酶切后,  重组到噬菌粒pComb3载体中。以其电转化大肠杆菌,  经辅助噬菌体超感染后收集上清即为噬菌体抗体库。人源抗体库构建原理与此相同。噬菌体抗体库的构建及鉴定具体操作过程参照文献［10］。

　　1.2.4  噬菌体抗体库的筛选及单克隆噬菌体抗体的制备  参照文献［11］,  以8.7 mg/L的人整合素ανβ3蛋白包被酶联板,  于4℃过夜。加含30 g/L的BSA的PBS于37℃封闭1 h,  洗板后加100 μL噬菌体抗体库(约1012cfu),  于37℃ 2 h。以TBST洗1次(第2轮洗5次, 第3轮后洗10次, 每次5 min),  加100 μL洗脱液（0.1 mol/L盐酸,  甘氨酸调pH至2.2,  加BSA至1%）回收噬菌体,  经3 mL中和缓冲液(2 mol/L Tris)调节pH至中性后感染2 mL细菌,  进行下一轮筛选,  共进行4轮筛选。从第3轮和第4轮淘筛后,  铺平板培养后,  各挑取20个单个菌落接种于2 mL SB培养基中,   于37℃培养至A600＝0.5～0.6。加20 μL VCSM13,  于37℃培养2 h后, 补加卡那霉素至70 mg/L,  过夜培养, 次日收集上清即为噬菌体抗体。

　　1.2.5  噬菌体抗体的抗原结合活性  用50 μL的人整合素ανβ3抗原包被酶联板于4℃过夜。以100 g/L脱脂奶粉封闭2 h后, 将上述噬菌体抗体与等量脱脂奶粉混合,  室温放置30 min 加入到封闭后的孔内, 每孔50 μL,  于37℃孵育2 h。用PBST洗板3次,  加入HRP抗M13抗体,  于37℃放置1 h。以PBST洗板3次,  加入TMB显色10 min（加A液后再加B液各1滴）,  用50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应,  用酶标仪测定A450值。检测中以辅助噬菌体VCSM13作为阴性噬菌体抗体对照。

　　1.2.6  噬菌体抗体的交叉反应性  取噬菌体抗体阳性的克隆与不同抗原BSA、 HBsAg、 木瓜蛋白酶和小鼠IgG进行交叉结合活性鉴定。即以各种抗原包被酶联板后,  其余步骤同间接ELISA。

　　1.2.7  噬菌体抗体的竞争抑制ELISA  以人整合素ανβ3抗原包被酶联板, 将不同稀释度的鼠抗人整合素ανβ3   mAb与抗人整合素ανβ3阳性的噬菌体抗体等体积混合后加入到酶联板中,  于37℃孵育2 h,  其余步骤同间接ELISA。抑制率＝｛（抑制前的A450值－抑制后的A450值）/抑制前的A450值｝×100%。抑制率＞50%者为阳性。

　　2  结果

　　2.1  含鼠mAb CDR3的人轻链和Fd基因库的构建  用RIzol试剂一步法从3个新生儿脐血中分离的淋巴细胞中提取总RNA,  经测定A260/A280=1.8,  表明总RNA的纯度较好。RNA琼脂糖凝胶电泳证明,  提取的RNA完整性较好。根据紫外测定值出RNA总量为186 μg。以总RNA反转录合成的cDNA 1 μL作为模板,  以扩增轻链和重链可变区基因5′端的引物和扩增骨架区FR3基因 3′端的引物配对,  分别扩增人抗体VH及VL FR1FR3基因。结果表明, 抗体轻链κ全部组合均能扩增出目的片段（约260 bp）。抗体λ链9种组合中, 有7种组合能扩增出目的片段（约260 bp）。未能扩增出Vλ4和Vλ70基因。抗体重链7种组合中, 有6种组合能扩增出目的片段,  未能扩增出VH6a基因。以本室保存的含有人抗体基因的B1HFLF质粒为模板,  经PCR扩增出含鼠mAb E10 CDR3基因的人源FR3KCDR3JCK和人源FR3HCDR3JCH1基因片段。将2个基因片段分别与人抗体VH及VL FR1FR3基因,  通过重叠PCR拼接构建了含鼠CDR3的人抗体重链Fd基因（约680 bp）和轻链κ、 λ基因（约640 bp）。

　　2.2  杂合噬菌体抗体库的构建及人源化轻链的筛选  将构建的鼠嵌合Fd基因经Xho I和Spe I双酶切后,  克隆入相同酶切的pComb3载体中。将κ、 λ基因混合后,  经Sac I和Xba I双酶切与含有鼠嵌合Fd基因的pComb3载体连接,  电转化大肠杆菌,  在辅助噬菌体的超感染下,  构建了杂合噬菌体抗体库。取1 μL和10 μL转化菌,  分别铺平板计数,  推算出抗体库的库容为2.1×106 cfu,  抗体库的滴度为8.96×1017 cfu/L。随机挑取20个菌落进行菌落PCR。结果表明, 杂合抗体库轻链基因的重组率为80%。经4轮筛选后,  测定每轮洗脱回收的噬菌体的滴度,  发现自3轮起有明显的富集(表1)。从第4轮淘筛后铺平板的菌落中,  随机挑选30个克隆制备单克隆噬菌体抗体,  用间接ELISA 检测其对人整合素ανβ3抗原的结合活性。结果表明,  有10个克隆呈ELISA阳性（以P/N>4判定为阳性）。为排除阳性克隆与其他抗原的交叉反应,  将初步鉴定为阳性的噬菌体抗体与BSA、 HBsAg、 木瓜蛋白酶和小鼠IgG进行ELISA测定。结果表明,  全部阳性的克隆均可与人整合素ανβ3  抗原产生结合反应,  而不与其他抗原反应,  说明这些阳性克隆具有与人整合素ανβ3抗原特异结合的活性(表2)。竞争抑制ELISA的结果显示,  鼠mAb E10能抑制其中3个B12、 B8和A20杂合噬菌体抗体克隆与人整合素ανβ3抗原的结合,  表明这3个杂合噬菌体抗体与亲本鼠mAb E10识别同一抗原表位。

　　表1  人整合素ανβ3抗原对杂合噬菌体抗体库的亲和富集效应　略

　　2.3  人源噬菌体抗体库的构建及人源抗体Fab的筛选  将从杂合克隆B12质粒中经Xba I和Sac I双酶切切出的人源轻链基因与人抗体重链Fd基因,  分别克隆入pComb3载体中。构建的人源噬菌体抗体库的库容为2×107 cfu,  抗体库的滴度为2.14×1017 cfu/L。人源抗体库中重链基因的重组率为50%。经3轮筛选发现, 噬菌体的滴度有明显的富集(表3)。

　　表2  抗人整合素ανβ3杂合噬菌体抗体交叉反应性的ELISA测定　略

　　表3  人整合素ανβ3抗原对人源噬菌体抗体库的亲和富集效应　略

　　2.4  人源Fab抗体的鉴定  从第3轮淘筛中挑选20个克隆制备人源单克隆噬菌体抗体,  用间接ELISA检测结果有8个克隆呈ELISA阳性。交叉反应性ELISA测定的结果表明, 这8个阳性克隆具有与人整合素ανβ3抗原特异结合的活性(表4)。竞争抑制ELISA的结果表明,  鼠mAb E10能抑制其中D5、 D10和C16人源噬菌体抗体与人整合素ανβ3抗原的结合,  提示这3个人源噬菌体抗体与亲本鼠mAb E10识别同一抗原表位。

　　2.5  人源抗体Fab的序列分析  对高亲和力的克隆D5轻、 重链基因的序列进行测定,  经VectorNTi软件分析表明,  抗体基因具有单一的开放阅读框架（ ORF）,  内部无终止密码子,  分别编码214和223个氨基酸。推导的序列内都含有5个半胱氨酸（Cystein,  C）,  轻链分别在免疫球蛋白标准位置的23、 89、 134、 194、 214位; 重链分别在免疫球蛋白标准位置的22、  96、  145、  201、 221位。其中C1和C2之间,  C3与C4 之间,  各形成一对链内二硫键,  构成2个免疫球蛋白结构域。轻链第214位半胱氨酸与重链221位半胱氨酸形成链间二硫键,  组成Fab段。用BLAST软件将抗体基因与KABAT数据库比较分析表明,  可变区有典型的抗体结构特征。其中,  轻链在24～34为CDR1区,  50～56为CDR2区,  90～98为CDR3区(GenBank中登录号为AY489290)。重链在26～35为CDR1区,  50～60为CDR2区,  98～107为CDR3区(GenBank中登录号为DQ192641)。将抗体可变区基因的序列与抗体胚系基因数据库（VBASE）相比较,  表明该抗体轻链基因属VKIII基因家族。来自胚系基因DPK21（humkv328h5+位点）,  J片段与JK1基因的同源性最高。抗体重链基因属VH1基因家族,  与胚系基因DP4+和72+同源性最高。D区和J 区基因分别是D316和JH6b。其中D区基因在重排时采用第2阅读框架。

　　表4  抗人整合素ανβ3人源噬菌体抗体交叉反应性的ELISA测定　略

　　3  讨论

　　整合素ανβ3是细胞黏附分子超家族中的成员,  由于其具有促进肿瘤血管生成和肿瘤转移的作用,  近年来备受重视。本室研制的抗人整合素ανβ3  mAb E10,  具有明显的中和整合素ανβ3促进肿瘤血管生成的活性。在体内、 体外试验中均表明,  其能有效地抑制肿瘤的生长,  显示出其临床肿瘤的良好前景。为使其更好的用于临床,  我们在克隆E10轻、 重链可变区基因的基础上,  运用CDR3导向抗体库的方法,  对其进行了人源化筛选。为确保所获可变区基因的多样性,  我们选择了由3名新生儿脐血来源的淋巴细胞克隆人源可变区基因。根据所获鼠mAb Fab CDR3基因的序列合成了一段含CDR3区基因的引物,  并通过重叠PCR获得含鼠mAb E10 CDR3区的人源重链Fd及轻链基因,  分别构建了库容为2.1×106、 2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库。经整合素ανβ3抗原筛选,  获得了与亲本鼠mAb识别相同抗原表位的人源化轻、 重链基因。所获人源化噬菌体抗体轻链基因具有典型的人免疫球蛋白基因结构特征。同源性分析及胚系基因分析表明,  轻链基因为VKIII基因家族,  抗体重链Fd基因为 IgG1亚类,  可变区属于VH1基因家族。本研究通过鼠CDR3对人抗体库的限定,  使所获抗体库具有预定的偏向性,  有利于特定抗体的筛选,  并初步证实该鼠mAb的人源化方法是切实可行的。

　　:

　　[1] Kretzschmar T,  von Ruden T. Antibody discovery:  phage display[J]. Curr Opin Biotechnol,  2002,   13(6): 598-602.

　　[2]  Brekke OH,  Loset GA. New technologies in therapeutic antibody development[J]. Curr Opin Pharmacol,  2003,  3(5): 544-550.

　　[3]  Jespers LS,  Roberts A,  Mahler SM, et al. Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen[J]. Biotechnol,  1994,  12(9):  899-903.

　　[4] 王卓智,  王  琰,  李  竟,  等. 用抗原表位定向选择人源化抗TNFα鼠Fab段[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,  1998,  18（6）:  490-494.

　　[5] Rader C,  Cheresh DA,  Barbas CF. A Phage display approach for rapid antibody humanization: Designed combinatorial V gene libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA,  1998,  95(15): 8910-8915.

　　[6] 王  臣,  侯利华,  张彦明,  等. 抗人整合素ανβ3鼠人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达[J]. 西北农林科技大学学报（版）,  2004,  32（5）:  9-13.

　　[7] 王  臣,  侯利华,  张彦明,  等. 抗人整合素ανβ3单链抗体的构建与表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志,  2004,  20（2）:  157-161.

　　[8]  Kang AS, Burton DR,  Lerner RA, et al. Combinatorial immunoglobulin libraries in phage λ[J]. Science,  1991,  2(2): 111-118.

　　[9] 王  臣. 预设CDR3导向噬菌体抗体库筛选人源化抗人整合素ανβ3单抗E10[D].  西北农林科技大学硕士学位,  2004.

　　[10] 杜桂鑫. 人源噬菌体抗体组合文库的构建及抗HAV噬菌体抗体的筛选[D]. 军事医学科学院硕士学位论文,  1998.

　　[11] Tsui P,  Tometta MA,  Ames RS,  et al. Progressive epitopeblocked panning of a phage library for isolation of human RSV antibodies[J]. J Immunol Methods,  2002,   263(1-2): 123-32