登革病毒感染对人血管内皮细胞PGIS表达及PGI2分泌的影响
【关键词】 登革病毒;,血管内皮细胞;,前列环素合酶;,前列环素
Effects of Dengue virus infection on PGIS expression and PGI2 secretion of human vascular endothelial cells
[Abstract] AIM: To elucidate the effects of Dengue virus on the expression and secretion of prostacyclin (PGI2) in endothelial cells. METHODS: Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were infected by Dengue virus II（DV2）for different duration. PGI2 level in the supernatant was determined by radioimmune assay. Cytoplasmic RNA of the infected HUVEC was prepared using the Trizol method and was assayed for prostacyclin synthase （PGIS）by RTPCR. RESULTS: PGIS expression as well as PGI2 secretion of the DV2 group were significantly increased (P<0.05) at 48 h, 72 h and 96 h postinfection compared to the control group. CONCLUSION: DV2 could promote the expression of PGIS mRNA in HUVEC and increase the level of PGI2, which may increase the vascular permeability. The dysfunction of vascular endothelial cell （EC） induced by DV may be related to the pathogenesis of Dengue haemorrhagic fever （DHF）and Dengue shock syndrome（DSS）.
[ Keywords]Dengue virus;vascular endothelial cell; prostacyclin synthase; prostacyclin
[摘 要] 目的: 研究登革病毒感染对人血管内皮细胞分泌血管活性物质前列环素（PGI2）的影响, 以了解登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS) 的发病机制。方法: 用登革病毒Ⅱ型感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC), 于感染后6、 12、 24、 48、 72、 96 h, 分别收集病毒感染的HUVEC, 用RTPCR检测细胞内前列环素合酶（PGIS）mRNA的水平; 分别收集病毒感染的上清液, 用放射免疫检测法测定PGI2 的含量。结果: 登革病毒感染可使PGIS mRNA 的水平增高, 导致HUVEC分泌PGI2的量明显升高。在病毒感染后48、 72、 96 h, 与对照组比较HUVEC表达PGIS mRNA的水平和HUVEC 分泌PGI2 的量明显升高(P<0.05)。结论: DV2感染可显著上调HUVEC中PGIS mRNA 转录及PGI2 的分泌, 导致登革病毒所致血管内皮细胞的功能障碍, 可能与DHF/DSS的发病机制有关。
[关键词]登革病毒; 血管内皮细胞; 前列环素合酶; 前列环素
登革热(Dengue fever, DF)是由登革病毒(Dengue virus, DV)引起的急性感染性疾病。在大多数情况下, DF是自限性的, 但如果成为登革出血热(Dengue haemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合征(Dengue shock syndrome, DSS)则很危险。DHF/DSS最突出的特征是, 血管渗漏、 出血, 系由于广泛的毛细血管渗透性增加所致。血管损伤的确切机制尚不完全清楚, 但诸多研究显示与血管内皮细胞的结构和功能变化密切相关。在体外, DV可感染内皮细胞, 使之释放多种血管活性物质[1, 2]。研究表明, DHF患者在低血压危险期PGI2有过度升高的趋势。另外, 血清中血栓素TXA/PGI的比值的下降程度也与登革病毒感染的严重程度相关[3, 4]。但体外DV对内皮细胞分泌的血管活性物质PGI2的影响尚未见报道。本研究中应用DV2体外感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后, 观察了DV对HUVEC表达PGI2的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 DV2标准株(New Guinea C 株, NGC株)为本教研室冻存, 采用微量病毒空斑法滴定, 病毒的滴度为2×1010 pfu/L。白蚊伊蚊(C6/36)细胞株为本教研室长期传代和冻存。新生小牛血清购于杭州四季青生物公司。RPMI1640 培养基、 胰蛋白酶和Hepes均为Gibco公司产品。CCK8为日本同仁化学研究所产品。Trizol 购自上海申能博采公司。RTPCR试剂盒为上海申能博采公司产品。PGI2和肌动蛋白A引物由北京赛百盛公司合成。6酮PGI放免试剂盒由北京解放军总院东亚免疫研究所提供。新生儿脐带由暨南大学第一附属妇产科提供。SABC免疫组化染色试剂盒为武汉博士德公司产品。鼠抗DV2 IgG免疫血清为本教研室制备。FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 HUVEC的培养 按[5]建立的方法进行。取新生儿脐带用1.25 g/L胰酶/0.1 g/L EDTA消化液灌注消化法, 从脐静脉中分离HUVEC。离心沉淀后, 加入含200 mL/L FCS的培养液(200 mL/L FCS、 RPMI1640培养液、 Hepes 5 g/L、 L谷胺酰胺30 mg /L、 青霉素1×105 U/L及链霉素100 mg/L), 接种于25 cm2 培养瓶中, 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养。3 d后待细胞贴壁生长至汇合状态, 用1.25 g/L胰酶/0.1 g/L EDTA液消化传代。选择生长状态良好的第2、 3代细胞进行实验。用免疫组化染色（ABC法）检测胞质中第Ⅷ因子相关抗原的表达。
1.2.2 DV2 对HUVEC 的感染性 将HUVEC接种到24孔板中, 细胞密度为5×107/L, 每孔加1 mL, 于37℃培养24 h后感染病毒。每孔接种经预先滴定的约为5×105 pfu的DV2, 使DV2的感染复数（multiplicity of infection, MOI）为10 pfu/细胞, 于37℃吸附2 h。弃感染上清, 用含40 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液洗2遍, 每孔加入该培养液0.5 mL, 阴性对照孔中加入RPMI1640培养液, 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。分别收集病毒感染后6、 12、 24、 48、 72和96 h的HUVEC, 制成细胞抗原片, 用间接免疫荧光法检测DV抗原阳性的HUVEC。
1.2.3 细胞活力的检测 将含有HUVEC的培养液(1×107细胞/L)分别加入5块96孔板中的24孔内, 每孔100 μL, 培养24 h后感染病毒。每孔接种经预先滴定的约为1×104 pfu的DV2, 使之MOI为10 pfu/细胞, 共接种12孔。对照组12孔接种含40 mL/L小牛血清的RPMI1640 培养液, 于37℃吸附2 h。弃感染上清, 用同一培养液洗3遍, 每孔加入同一培养液100 μL。分别于培养6、 12、 24、 48和72 h, 取出其中一块96孔板, 于实验各孔中分别加入CCK8试剂10 μL, 于37℃培养1 h后, 用BioRAD model 450酶标仪于检测波长为450 nm参数波长为655 nm, 测定吸光度(A)值。
1.2.4 DV对HUVEC分泌PGI2的动态观察 取培养2～4 代的HUVEC接种到24孔板中, 细胞密度为5×107/L, 每孔加1 mL, 于37℃培养24 h。实验分组: 实验组每孔接种经预先滴定的DV2约为5×105 pfu的DV2, 使之MOI为10 pfu/细胞, 于37℃吸附2 h。弃感染上清, 用含40 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液洗2遍, 每孔加入同一培养液0.5 mL。对照组每孔加含40 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液。分别收集培养6、 12、 24、 48、 72和96 h实验组和对照组的培养上清。每次收集4孔, -20℃保存, 用特异性放射免疫法测定6酮前列腺素F1（6ketoPGF1α）的含量, 实验重复3次。
1.2.5 PGImRNA表达的RTPCR检测 以软件primer5.0设计扩增PGI2 基因的引物, 扩增片段长为310 bp。上游引物的序列为: 5′ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′, 下游引物为: 5′CCTTCTAAGTGGTTGGAACA3′。采用肌动蛋白A (βactin基因)为内对照, 扩增片段长为114 bp, 上游引物为: 5′ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′, 下游引物为: 5′ATCTTCAAACCTCCATGATG3′。主要步骤包括: （1）总RNA 提取: 采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法提取。分别收集的6、 12、 24、 48、 72和96 h实验组和对照组中培养细胞的总RNA。（2）逆转录反应(上海申能博采公司): 总RNA 4 μL、 Oligo1（dt）18 (50 pmol/L) 1 μL及双蒸水7.5 μL, 于70℃变性5 min, 0℃冰浴5 min。加入RNA 酶抑制剂0.5 μL、 10 pmol/L dNTP 2 μL、 5×扩增缓冲液4 μL、 MMLV 逆转录酶1 μL, 使反应总体系为20 μL, 于37℃温浴60 min。再将反应混合物加热至95℃, 5 min。(3)PCR 反应: 反应体系包括cDNA 2 μL、 10 pmol/L dNTP 0.5 μL、 25 pmol/L MgCl2 μL, 10×扩增缓冲液2.5 μL、 50 pmol/L上、 下游引物各0.2 μL及Taq DNA 聚合酶0.5 μL, 加水至终体积为20 μL。首轮变性94℃ 5 min, 后续变性94℃ 30 s, 退火65℃ 30 s, 延伸72℃ 90 s, 共30个循环, 终末循环后于72℃延伸10 min。(4)PCR 产物的半定量: 取PCR产物10 μL, 进行在20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外透视仪下检测所获条带, 并进行吸光度扫描分析, 结果以前列环素合酶（PGIS） mRNA 扩增条带与βactin基因的扩增条带的扫描峰面积比, 表示PGIS mRNA 的相对含量。
1.2.6 统计学处理 所有数据均以x±s 表示, 应用方差分析进行统计学检验各因素的作用效果, 进一步应用独立样本t检验检验不同组别相同时段目的基因表达水平的差异性, 应用单因素方差分析检验DV2组不同时段时效变化的差异性。P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1 HUVEC的分离与鉴定 所分离的HUVEC在相差倒置显微镜下观察, 细胞为单层鹅孵石状镶嵌排列。ABC免疫组化染色法显示, 细胞胞质中第Ⅷ因子相关抗原呈阳性, 阳性的的黄色颗粒均匀地分布在整个细胞质, 苏木素复染后, 细胞核呈蓝色(图1), 证明所分离的细胞为HUVEC。间接免疫荧光法检测结果显示, 感染后12 h, 开始出现荧光阳性的细胞, 胞质及胞膜呈现微弱荧光(+), DV2特异性抗原在HUVEC的胞质内呈灶性分布, 24 h后荧光增强, 48 h后最强, 细胞胞质内出现片状或颗粒性黄绿色荧光(图2)。72 h荧光开始减弱, 96 h后荧光明显减弱。
2.2 DV2对HUVEC活性的影响 实验组细胞在培养的6～96 h各个不同时段, 应用CCK8所得的活力与对照组相比无统计学差异(P>0.05), 提示DV2对HUVEC活力无影响。
2.3 登革病毒感染对HUVEC分泌6ketoPGF1α的影响 感染组和对照组的6ketoPGF1α分泌水平差异显著(P<0.05)。独立样本t检验检测不同时段的差异性, 在各时段DV组与对照组均有差异, 提示DV感染可使HUVEC分泌6ketoPGF1α的能力显著增加(表1)。感染后48、 72及96 h, 分泌的6ketoPGF1α量与6、 12、 24 h比较差异显著(P<0.05), 提示DV感染后HUVEC分泌6ketoPGF1α的能力有缓慢上升的趋势。对照组6ketoPGF1α的分泌量各时间点差异无显著性。
图1 －图2 略
表1 DV2诱导的HUVEC分泌6ketoPGF1α水平的变化 略
2.4 DV2对HUVEC的PGIS mRNA 转录的影响 对照组和DV2组均可扩增出相应目的基因片段, 其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实, 扩增的目的基因片段的大小较预期的结果相一致(图3、 4)。应用图象分析处理系统进行灰度扫描, 并进行扫描面积积分, 比较DV2组和对照组RTPCR扩增的PGIS/βactin目的DNA片段的灰度比值。重复测量的方差分析结果: P<0.05; 单因素方差分析DV2组不同时相间也有差别(P<0.05), 其中感染后48 h与其他时间点均存在差别(均为P<0.05), 72及96 h与其他时间点也有差别（P<0.05）。独立样本t检验检测不同时段的PGIS的mRNA表达水平的差异性, 在各时段DV2组与对照组差异均有统计学意义, 提示DV2组PGIS 的mRNA表达水平高于对照组。DV2组PGIS mRNA的表达水平在感染48 h后显著升高; 在感染96 h内不同时相均高于对照组(表2)。
图3 扩增的目的基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 略
表2 DV2诱导的HUVEC表达PGIS/βactin mRNA水平的变化 略
3 讨论
近年来, DV多次在东南亚地区爆发, 是这些地区儿童的主要死亡因素之一。DHF/DSS主要临床表现为血浆的渗漏和出血, 当出现血容量减少性休克时[6, 7], 如不及时可危及生命。血管内皮细胞是DV感染的靶细胞, 存在多种途径参与DHF/DSS的发病。DV感染可以使血管内皮细胞分泌的多种因子, 如IL6, IL8[8], TM, tPA等[1]发生紊乱, 进而影响血管内环境的稳态。表明血管内皮细胞受累是DHF/DSS的发病过程中一个极其重要的因素。本研究首先应用CCK8检测了DV2对HUVEC的毒性并对其增殖进行分析, 该法的灵敏度和精密度远高于MTT法[9]。结果显示, DV2(MOI=10)感染HUVEC前后与对照相比, 其反应产生的甲染料(Formazan dye)在450 nm的A值虽有升高的趋势, 但均没有统计学差异, 提示DV2感染对HUVEC的活性无明显影响。血管内皮细胞通过调节局部凝血/抗凝血机制的动态平衡, 以保持血液的正常流动状态。最近研究[1, 10]证实, 血管内皮细胞在DV感染过程中分泌与凝血和纤溶相关的分子失调。在局部的抗凝机制中, 内皮细胞所合成和分泌的(PGI2)起着非常重要的作用, 其参与了局部抗凝、 扩张血管等生理和病理过程。PGI2是具有生理活性的花生四烯酸代谢产物, 在磷脂酶A2的作用下, 细胞膜内磷脂裂解为花生四烯酸, 经环氧化酶途径氧化, 生成前列腺素G2（PGG2）。PGG2可经氧化酶作用形成前列腺素H2（PGH2）, PGH2的活性极不稳定, 于内皮细胞内, 在PGIS的作用下可形成PGI2。PGI2是迄今发现的作用最强的内源性血小板聚集抑制剂, 比腺苷的作用强1000倍, 并有较强的舒张血管、 增加血管通透性的作用。在体内低浓度的PGI2可抑制由腺苷二磷酸(ADP) 形成的微血管栓塞。PGI2通过与细胞膜上的相应受体相结合, 可激活腺苷酸环化酶, 使胞内的环腺苷酸(cAMP)含量升高, 发挥其松弛平滑肌细胞和抑制血小板聚集的作用。Preeyasonbat 等[3, 4]的临床研究发现, DHF患者尤其是在有低血压休克危险时, 血清中的PGI2有过分升高的趋势。在另一个研究中, 他们发现血清中PGI2的平衡因子TXA2在有低血压休克危险时降低, 提示当TXA2不能完全代偿PGI2的升高时, 患者更易发生休克的危险。研究还发现TXA2/PGI2的重要意义: 二者比值的降低提示临床表现更加严重。此种作用是DV的单独作用还是一些细胞因子的作用, 或者是病毒与细胞因子的协同作用至今尚未阐明。由于PGI2在内皮细胞抗凝机制中发挥着重要的作用, 而DHF/DSS患者又表现出明显的凝血障碍性出血倾向, 我们通过体外实验, 检测DV2感染的内皮细胞对PGIS的合成及PGI2的分泌的影响, 以初步反映病毒感染对内皮细胞抗凝功能的影响。由于PGI2不稳定, 最终变成稳定的产物6KetoPGF1α, 目前一般以测定6KetoPGF1α的浓度代表PGI2的浓度。本实验中发现, DV2感染后, 血管内皮细胞中6ketoPGF1α的合成和分泌明显增高, 并且随着时间推移有相应增加的趋势。为了进一步研究PGI2升高的机制,同时对PGI2合成的关键酶PGIS进行了研究, 发现PGIS的mRNA水平在48 h开始有明显的升高, 96 h达到最高。以上实验表明, DV2感染HUVEC, 可导致内皮细胞分泌PGIS的功能在转录水平受到一定的影响, 从而影响PGI2的分泌量。这种改变具有一定的时间效应关系。本实验的结果与临床报道[3, 4]的结果相吻合。可部分地解释临床DHF/DSS患者血浆中PGI2升高的现象。本实验结果表明, DV感染可增加血管内皮细胞PGIS mRNA转录水平表达及血管活性物质PGI2的分泌, 导致血管通透性增加和凝血、 止血功能障碍, 可能是DHF/DSS的重要的发病机制。当然, 血管内皮细胞内环境的稳态涉及到多种分子复杂的调控, 包括促进血栓形成的因素和抗凝因素的平衡系统和调控系统等, 显然对单一分子的研究还不能完全说明问题, 但为进一步的研究提供了一定的实验资料。
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