孤啡肽诱导白血病细胞K562凋亡
作者：郭鸿 赵丽 张宝红 李娟 陈轩
【摘要】 本研究探讨孤啡肽对白血病细胞K562增殖的影响及诱导凋亡的作用，采用MTT（四唑氮蓝）法检测不同浓度的孤啡肽对K562细胞生长的影响，应用瑞氏染色、显微镜观察药物作用后K562细胞形态的改变，流式细胞术检测孤啡肽对K562细胞细胞凋亡作用，DNA琼脂糖凝胶电泳观察孤啡肽作用后K562细胞内DNA的损伤程度。结果表明： 10-6-10-13 mol/L孤啡肽明显抑制K562细胞的生长，且存在时间依赖性，而剂量依赖性不明显； 10-6-10-7、10-9、10-12 mol/L孤啡肽作用72小时后显示明显的细胞毒作用。与对照组相比，10-9 mol/L孤啡肽作用72小时后K562细胞出现典型凋亡特征；流式细胞术检测发现： 0、10-7、10-8、10-9 mol/L孤啡肽作用72小时后出现凋亡峰，凋亡率分别为0%、22.8%、23.8%、26.5%； DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯状条带。结论： 孤啡肽能够抑制K562细胞增殖，诱导其凋亡。
【关键词】 孤啡肽； 白血病； 细胞凋亡； K562细胞
Apoptosis of K562 Cells Induced by Nociceptin/Orphanin FQ
AbstractThe study was to investigate the prolilferation and apoptosis effect of nociceptin/orphanin FQ (OFQ) on 562 cells in vitro. Inhibition of K562 cells prolilferation was measured by MTT assay. Morphological assessment of apoptosis was performed with Wright staining and transmission electron microscope. The apoptosis peak was measured by flow cytometry. DNA fragmentation was visualized by agarose gel electrophoresis. The results showed that OFQ time-dependently and no-dose-dependently inhibited the proliferation of K562 cells at concentrations of 10-6-10-13 mol/L. Discrete maximum of cytolytic activity was detected at concentrations of 10-6-10-7,10-9,10-12 mol/L. Compared with the control group K562 cells, the cells treated with OFQ at concentration of 10-9 mol/L for 72 hours showed typical characteristics of apoptosis under transmission electron microscope. Apoptosis peak was found by FCM at concentration of 0,10-7,10-8,10-9 mol/L of OFQ for 72 hours, apoptosis rates were 0%,22.8%,23.8% and 26.5% respectively. DNA agarose gel electrophoresis revealed nuclear fragmentation (DNA ladder). It is concluded that OFQ can inhibit the proliferation of K562 cells and induce the apoptosis in K562 cells.
Key wordnociceptin/orphanin FQ; leukemia; apoptosis; K562 cell
内源性阿片肽是在哺乳动物脑内天然形成的具有阿片样活性的物质。以前，阿片及其受体的研究一直是分子神经药和神经生物学研究的热点，如其代表吗啡已广泛用于术后镇痛。但是近年来大量的研究证明，阿片肽参与神经系统、内分泌系统及免疫系统的调节，并具有抗肿瘤和诱导细胞凋亡的作用［1］。曾有吗啡、脑啡肽［2］、埃托啡［3］、内吗啡肽［4］诱导细胞凋亡的报道，孤啡肽也是内源性阿片肽家族的成员，但尚未见相关报道。本实验采用K562细胞为靶细胞，研究孤啡肽对K562细胞增殖的影响，探讨孤啡肽作为白血病药物的可能性和作用机制。
材料和方法
材料
白血病细胞系K562为兰州大学第一中心实验室保存的细胞系。孤啡肽由兰州大学生命院合成、表征和纯化，纯度>99 ％，相对分子量为1 809。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季清生物有限公司产品。
细胞培养
人白血病细胞K562细胞为悬浮生长的细胞，用含10 ％小牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5 ％ CO2、饱和湿度条件下常规培养。
药物对细胞生长影响的四唑氮盐（MTT）比色法观察
取对数生长期的K562细胞，以2×105/ml的密度接种于96孔板中，设10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13 mol/L孤啡肽作用组，每个浓度设4个复孔，同时设阴性对照。作用终止前4小时加入MTT溶液（浓度为5 μg/ml），培养4小时后离心吸去上清，加入100 μl的DMSO，37℃培养10分钟，待结晶完全溶解后，用酶标仪于490 nm处测量吸光度A值，孤啡肽对K562细胞增殖的抑制率（inhibition rate， IR）。IR=［(Acontrol-Asample)/Acontrol］×100 %
细胞形态学观察
收集经10-9 mol/L孤啡肽处理72小时的K562细胞和对照组K562细胞后，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，一部分细胞涂片，常规瑞氏染色；另一部分用0.25 %的戊二醛固定24小时，1 ％四氧化二锇固定2小时，用0.1 mol/L PBS洗2次，梯度丙酮脱水，Epon812包埋，制作超薄切片，电子染色，EM-2000EX电镜观察超微结构。
细胞周期及细胞凋亡的流式细胞术测定
分别收集处理组和对照组细胞，用预冷的PBS洗2次，离心去上清，加入2 ml无水乙醇固定过夜，加入DNA-prepstain染液染色后，用EPIC-XL流式细胞仪（FCM Coulter 公司产品）检测各组细胞的荧光强度，每份样品检测约5 000个细胞，应用DNA Multi Cycle软件进行统计学拟合分析。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
收集经10-9 mol/L孤啡肽处理72小时的K562细胞和对照组K562细胞后，用PBS洗2次，加入细胞裂解液，按上海生工生物有限公司 SK1261试剂盒的用过柱法提取DNA后，2%琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为1×TBE，在恒压100 V下电泳1小时（DYY-ШB-12型电泳仪，北京市六一仪器厂产品）。
统计学处理
数据用单因素方差进行统计学分析。
结果
细胞增殖抑制率
白血病细胞经孤啡肽作用24小时后，开始出现不同程度的抑制，抑制作用具有很好的时间依赖性，随作用时间的延长而增强（图1、2、3）。10-9 mol/L孤啡肽对K562细胞作用96小时抑制率最高，72小时后 10-6-10-7 mol/L、10-9 mol/L、10-12 mol/L 3个浓度显示有明显的细胞毒作用（P<0.05）。
K562细胞形态的变化
与对照相比，K562细胞经10-9 mol/L孤啡肽处理72小时后即出现明显形态学改变。瑞氏染色显示，经孤啡肽处理的K562细胞胞质丰富，并出现大量的空泡和核碎裂（图4）。显微镜下观察发现，K562细胞经10-9 mol/L孤啡肽处理72小时后，与对照组比较，细胞表面微绒毛消失，胞浆固缩，细胞内出现大量的空泡，且空泡内有残留物质，染色质凝集成团块状，分布于核膜边缘（图5）。
流式细胞仪检测结果
经FCM检测发现，K562细胞经0、10-7 、10-8 、10-9 mol/L的孤啡肽作用72小时后，出现明显的凋亡峰, 凋亡率分别为0%、22.8%、23.8%、26.5%（图6）。
DNA Ladder测定
DNA琼脂糖凝胶电泳显示，用10-7 、10-8、10-9 mol/L的孤啡肽作用K562细胞72小时后，基因组DNA显现凋亡细胞典型的梯状图谱（图7），说明DNA在核小体间的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，由于寡聚核小体的长度为180-200 bp，所以DNA凝胶电泳形成了180-200 bp整数倍的"梯状条带"。
讨论
1972 年Kerr［5］等人首先提出了细胞凋亡的概念，区分了细胞凋亡与细胞坏死，经过后人研究证明细胞凋亡是一个具有特征形态和生化改变的生物学过程，形态学改变主要表现为细胞皱缩、核致密化以及最终凋亡小体的形成；生化改变则是 DNA在核酸内切酶的作用下于核小体之间断裂，形成的180-200 bp整数倍的片段。越来越多的研究表明，细胞凋亡与多种疾病的发生有着密切的关系，特别是肿瘤的形成。目前临床上已把抑制白血病细胞增殖、诱导其凋亡和分化作为白血病的重要手段。近年来研究发现，神经肽作为一个正常细胞潜在的生长因子，它可通过自分泌、旁分泌、神经分泌和内分泌的方式参与到肿瘤细胞的增殖及分化过程中［6］。阿片肽是1975年发现的第一类肽类神经递质,包括吗啡、内啡肽、脑啡肽、强啡肽和孤啡肽等。Shavit等［7］首先认为，阿片肽有促进肿瘤生长的作用，而有的报道吗啡、脑啡肽［2］、埃托啡［3］、内吗啡肽［4］均有诱导细胞凋亡的作用。面对相互矛盾的结论，本实验采用K562细胞为靶细胞，观察孤啡肽对该细胞增殖的影响。本实验研究发现，孤啡肽能明显抑制K562细胞的生长，在 10-6-10-13mol/L浓度范围内，10-6-10-7、10-9、10-12 mol/L孤啡肽作用72小时对K562细胞较高的杀伤性，而在96小时10-9 mol/L孤啡肽的杀伤性最强。这种现象可能与以下几方面有关： ①处于不同周期的细胞对细胞毒作用的敏感性不同［8］； ②如Ponton等［9］所述，不同浓度的溶细胞物质可以出现多重效应，包括诱导或抑制凋亡；阿片物质具有促生长和促死亡双重作用，促生长效应是通过Akt和胞外信号调节酶作用，引起信号级联反应实现的；促死亡效应是通过抑制核内NF-кB，fas表达增加，p53稳定，NO合成酶的活化等多种机制完成的； ③靶细胞的不同数目也可以对同一信号有不同效应。同时，几个不同因素也可以以多种模式共同作用使细胞凋亡。蛋氨酸-脑啡肽在10-15 mol/L时就可以诱导细胞凋亡［2］，说明其效应具有高度特异性。吗啡的细胞毒作用在10-6-10-7 mol/L水平、内吗啡肽在10-4-10-5 mol/L水平上可诱导HL-60细胞调亡［4］，而孤啡肽在10-9 mol/L水平上可诱导K562细胞凋亡，说明其对K562细胞的作用强度强于吗啡与内吗啡肽，弱于脑啡肽。内源性阿片肽家族中孤啡肽与脑啡肽的高度特异性显示了阿片肽在肿瘤细胞凋亡中的作用。本实验还通过流式细胞仪检测到细胞经10-7 、10-8、10-9 mol/L孤啡肽作用72小时后出现凋亡峰。DNA琼脂糖凝胶电泳显示，用10-7 、10-8、10-9 mol/L的孤啡肽作用K562细胞72小时后，DNA显现凋亡细胞典型的梯状条带。这说明孤啡肽抑制K562细胞生长主要是通诱导细胞凋亡方式，孤啡肽究竟通过何种机制发挥作用，仍待研究。
【】
1 赵丽云. 阿片类药物的促细胞凋亡作用及其机制. 国外医学·麻醉学与复苏分册，2002; 23：369-372
2 Mernenko OA， Blishchenko EY， Mirkina II， et al. Met-enkephalin induces cytolytic processes of apoptotic type in K562 human erythroid leukemia cells. FEBS Lett, 1996; 383:230-232
3 郑震林，尹德领，裴钢等. 埃托啡诱导神经细胞凋亡的实验研究. 南通医学院学报，1997;17:446-448
4 Lin X, Chen Q, Xue LY, et al. Endomorphins, endogenous opioid peptides, induce apoptosis in human leukemia HL-60 cells. Can J Physial Pharmacol, 2004; 82:1018-1025
5 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972; 26:239-257
6 Rozengurt E. Neuropeptides as growth factors for normal and cancerous cells. Trends Endocrinol Metab, 2002; 13:128-134
7 Shavit Y, Terman GW, Martin FC, et al. Stress, opioid peptides, the immune system, and cancer. J Immunol,1985; 135(2 Suppl): 834s-837s
8 Tegeder I, Geisslinger G. Opioids as modulators of cell death and survival--unraveling mechanisms and revealing new indications. Pharmacol Rev, 2004; 56:351-369
9 Ponton A, Clement M, Stamenkovic I. The CD95(Apol/Fas) receptor activates NF-Kappa β independently of it cytotoxic function. Biol Chem, 1996; 271: 8991-8995
