活化Chk1引起的G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨

      作者：王海燕　张敏　邹萍　游泳　郭静明　唐晓琼　赵智刚 吴耀辉

【摘要】  　　本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响，探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制。以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02（耐阿霉素）为研究对象,与阿霉素共孵育后，用流式细胞术检测细胞周期分布，RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平，Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平；靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后，用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况。结果表明：阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为（54.12±0.57）％，显著高于K562细胞（36.99±1.28）%； Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异； Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56，在K562细胞为0.27 ± 1.47，其差异有统计学意义。转染Chk1shRNA后，两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降。转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍。结论： Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。

【关键词】  Chk1　 G2/M期阻滞　 K562细胞　 K562/A02细胞　RNA干扰　 白血病细胞耐药

　　Mechanism of G2/M Blockage Triggered by Activated-Chk1 in Regulation of Drug-resistance in K562/A02 Cell Line

　　Key wordsChk1; G2/M arrest; K562 cell; K562/A02 cell line; RNA interference;   leukemia cell  drug-resistance

　　细胞周期G2/M检测点是监控细胞进入有丝分裂期的重要关卡。当放疗及化疗等因素致细胞DNA双链断裂（double strand breaks, DSB）后，三磷酸肌醇激酶的激酶(PIKK)家族成员ATR识别受损的DNA，将损伤信号通过其下游的因子如H2AX、
NBS1、BRCA1传递给细胞周期检测点激酶，从而使细胞周期阻滞在G2/M期，修复受损的DNA，使其继续进入细胞周期；如损伤广泛，则诱导凋亡。已有研究表明，化疗药物顺铂、丝裂霉素C引起的G2/M期阻滞延长与肿瘤细胞抗凋亡能力增强有关［1］；而且，原发耐药的肿瘤细胞本身具有阻滞在G2/M期的能力，且在此期延长［2］。这些结果表明，G2/M期检测点在肿瘤细胞耐药中发挥重要作用。细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase1, Chk1）是调控G2/M期检测点主要效应分子之一。我们前期的研究表明，应用RNA干扰技术抑制Chk1在K562/A02细胞中的表达，解除了G2/M期阻滞，增强了阿霉素诱导的细胞凋亡，这说明了Chk1参与了K562/A02细胞的耐药。但Chk1是如何影响肿瘤细胞的耐药特性尚不清楚，对此本研究作了进一步探讨。
 
　　材料和方法

　　材料和试剂

　　K562细胞系敏感株K562、多药耐药株K562/A02为本室保存株。携带绿色荧光蛋白（GFP）的RNAi真核表达载体pEGFP-H1和针对Chk1基因的短发夹状RNA（shRNA）pEGFP-H1/Chk1shRNA均由本室构建并经测序证实。RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司。逆转录试剂盒购自MBI公司，Taq DNA聚合酶购自北京天为时代生物公司。质粒小量柱式抽提试剂盒购自上海华顺生物公司。人β-actin和Chk1引物由上海生物工程公司合成。G418、碘化丙锭（PI）购自Sigma公司。兔抗人Chk1磷酸化抗体(S345)购自Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为北京中山生物工程公司产品。AnnexinV-cy5凋亡试剂盒购自Becton Dickinson公司。

　　方法

　　细胞培养K562、K562/A02于含10％胎牛血清、青霉素100  U/ml、链霉素100  μg/ml的RPMI 1640培养液中，在37℃、5％ CO2、水饱和湿度条件下培养。以常规方法诱导K562/A02细胞的耐药性［ 3］，并于实验前两周置于普通培养液进行培养。

　　细胞周期分析分别收集阿霉素(1 μg/ml)作用后6小时、24小时的K562、K562/A02两组细胞各1×106个，设未经药物处理的空白对照组，以冰冻的PBS洗2次，70%的乙醇4℃固定过夜，离心去上清，PBS洗2次后，加入0.3 ml  20 μg/ml的PI（含0.2 mg/ml  RNA酶）染色，室温避光30分钟，用流式细胞术检测细胞周期的分布。

　　半定量RT-PCR分别收集阿霉素处理6小时后各组细胞2×106 个，TRIZOL试剂提取其总RNA，紫外分光光度计测定RNA的含量，以3 μg  RNA为模板逆转录成cDNA后，进行PCR反应，以β-actin为内参照。β-actin 的PCR引物序列为：上游引物5'-TGTACGTTGCTATCCAGGCT-3'，下游引物5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'，产物长度241 bp。Chk1 的PCR引物序列为：上游引物5'-TGAAGCCGGCCGTAGACT-3'，下游引物5'-TCCACAGGACCAAACATC-3'。PCR的扩增条件：95℃预变性3分钟, 95℃变性1分钟, 55℃退火50秒, 72℃延伸1分钟，这3步循环30次，72℃延伸5分钟。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。
Chk1磷酸化水平Western blot检测细胞分组处理同上，按照［4］提取蛋白样品，每泳道以10 μl作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，BSA封闭1小时, 一抗为兔抗人Chk1-S345(1∶1 000)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔，以β-actin为内参，经ECL系统显色，扫描后用BandScan软件分析，目的条带与内参条带的光密度比值。

　　细胞转染 、鉴定K562和K562/A02细胞各分组如下： ①未转染对照组、②PEGFP-H1空载体转染组、③PEGFP-H1/Chk1转染组。细胞密度调整为1×105/ml，在560 V，60 μs，电击1次的条件下行电穿孔转染（Eppendorf电转仪，购自基因公司），转染后的细胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养24-48小时后，在荧光显微镜下观察转染效果。并在培养液中加入G418（终浓度400 μg/ml）筛选稳定株。实验前，换用不含G418的培养液，细胞处理和方法同Western blot。

　　细胞凋亡检测细胞分组同细胞转染、鉴定，收集阿霉素诱导凋亡6小时后的各组细胞和未处理的空白对照组，PBS洗2次后，调整细胞浓度为2×105/ml，分别经AnnexinV-cy5标记后，流式细胞术检测细胞凋亡。

　　统计学分析

　　以上实验均重复3次。实验数据应用SPSS 11.5软件包进行分析，所有结果均以均数±标准差（±SD）表示，两组间均数比较采用t检验，配伍组间比较采用多因素方差分析， P<0.05为有统计学意义。Table.  Effect of adrimycin(1 μg/ml) on cell cycle distribution of the K562 and K562/A02 cell lines（略）.

　　结果

　　细胞周期的分布

　　阿霉素作用6小时后，K562细胞分布在G2/M期的百分率为(36.99 ± 1.28)％，K562/A02为(54.11 ± 0.57)％，两者差异有显著性（P<0.05），提示在耐药细胞株中G2/M期的阻滞明显延长，且于6小时阻滞在G2/M期的细胞较高（附表） 。

　　Chk1mRNA水平在K562和K562/A02间的表达差异

　　由PCR电泳可见，β-actin与Chk1分别位于241 bp和461 bp处(图1)，通过凝胶图像分析仪扫描Chk1与β-actin条带的光密度比值：K562细胞为0.82±0.76，K562/A02为0.86±1.41，可见Chk1mRNA水平的表达在两株细胞内无显著差异（P>0.05）。

　　Chk1磷酸化水平在K562和K562/A02间的表达差异

　　Weston-blot分析显示,K562/A02细胞的Chk1磷酸化水平显著高于K562细胞（图2），扫描电泳条带的灰度比值分别为0.79 ±0.56和0.27 ± 1.47，两者差异有显著性（P<0.05）， Chk1的活化水平与G2/M期细胞的百分比呈正相关。

　　Chk1shRNA对Chk1磷酸化水平的影响

　　转染Chk1shRNA的细胞，由于shRNA靶向抑制了Chk1mRNA表达，使磷酸化水平下降。K562细胞转染组的Chk1磷酸化水平较空载体组下降73%，而K562/A02细胞转染组的Chk1磷酸化水平较空载体组下降85%，Chk1shRNA转染组细胞与空载体组、未转染组相比有显著差异（P<0.05），但转染组细胞K562与 K562/A02两者间无显著差异（图3）。

　　细胞凋亡的检测

　　应用Annexin V-cy5凋亡试剂盒检测上述各组细胞的早期凋亡发现，阿霉素处理6小时后，K562、K562/A02细胞空载体组的凋亡率分别为42.13% ± 1.12%、5.43 % ± 1.25%,而shRNA转染组细胞在阿霉素作用6小时后，K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体组的1.30倍和3.84倍，可见下调Chk1的表达后， K562/A02细胞凋亡率上升更显著（P<0.05）（图4）。

　　讨论

　　肿瘤细胞耐药机制非常复杂，其中一个重要机制是细胞周期检测点的活化参与了耐药的形成。尤其是G2/M期检测点的活化，其作用尤为突出，因为 ① 许多抗肿瘤药物作用于细胞周期； ②绝大部分肿瘤细胞具有获得性的G1/S期检测点缺陷，而依赖于G2/M期检测点的保护功能，肿瘤细胞的这种特性使其有别于正常细胞，也提示G2/M期检测点是一个潜在的肿瘤的特异性靶点［5］； ③与多药耐药相关的P糖蛋白(Pgp)的逆转剂除了增加细胞内药物浓度外，其细胞毒作用也与G2/M期的阻滞解除有关［6］。因此，与G2/M期阻滞相关的细胞周期检测点激酶Chk1、Chk2起重要作用。但有报道，在P53缺陷的肿瘤细胞中，是Chk1而非Chk2参与了细胞的损伤反应［7］，故探讨Chk1在肿瘤细胞耐药机制中的调控尤为重要。 本研究发现，在阿霉素诱导下，耐药细胞株K562/A02的G2/M期阻滞明显较敏感细胞株K562延长, 这一现象与Chk1磷酸化水平升高密切相关，但与Chk1mRNA表达水平无关；下调Chk1的表达后，K562/A02细胞凋亡率增加了近3倍，较K562细胞增加显著，此结果与相关文献报道较为一致［4，8］。因此，活化的Chk1通过延迟细胞进入有分裂期以修复受损的DNA，从而提高细胞的增殖活性，且活化水平的高低使不同的细胞表现为程度不一的抗药性；而G2/M期阻滞的解除更有利于增强DNA损伤剂对耐药细胞的杀伤活性。上述结果表明，Chk1磷酸化水平是影响肿瘤细胞耐药性的重要因素。但它又是如何影响随后的DNA修复及修复后细胞周期的恢复，其机制尚不清楚。故对此方面研究将为阐明肿瘤细胞的耐药机制提供有意义的材料。此外，本课题将质粒载体构建的Chk1shRNA导入靶细胞，使其在细胞内高效转录，实现了良好的抑制效果。与反义寡核苷酸和Chk1小分子抑制剂(咖啡因、UCN01等)相比，RNA干扰(RNA interference, RNAi)诱导的基因沉默显示了其高稳定性、高效率性、高特异性、高穿透性、低毒性等优点，使其在肿瘤基因治疗中有着良好的应用前景［9］。总之，细胞周期G2/M检测点是肿瘤细胞有别于正常细胞的一个保护机制，因此对于其效应分子—Chk1在白血病细胞耐药机制中作用的研究将为难治性、复发性白血病的治疗提供新的靶点，而RNA干扰技术与常规抗肿瘤治疗结合可能为克服肿瘤细胞耐药提供新的有效治疗途径。

【文献】
  　　1 Slupianek A, Hoser G, Majsterek I, et al. Fusion tyrosine kinases induce drug resistance by stimulation of homology-dependent recombination repair, prolongation of G2/M phase, and protection from apoptosis. Mol Cell Biol， 2002; 22: 4189-4201

　　2 Goldwasser F, Shimizu T, Jackman J, et al. Correlations between S and G2 arrest and the cytotoxicity of camptothecin in human colon carcinoma cells. Cancer Res, 1996; 56:4430-4437

　　3 栾凤君，杨纯正，马建国等. 一株人红白血病多药耐药细胞系K562/A02的建立及其耐药特性的研究. 中华肿瘤杂志，1993; 15:101-103

　　4 Yin MB, Hapke G, Wu J, et al. Chk1 signaling pathways that mediated G2/M checkpoint in relation to cellular resistance to the novel topoisomerase I poison BNP1350. Bichem Biophys Res Commun, 2002; 295: 435-444

　　5 Kawabe T. G2 checkpoint abrogators as anticancer drugs. Mol Cancer Ther, 2004; 3:513-519

　　6 Yin MB, Guo B, Voigt W, et al. Novel cellular determinants for reversal of multidrug resistance in cells expressing P170-glycoprotein. Biochim Biophys Acta, 1998; 1401:265-276

　　7 Carrassa L, Broggini M, Erba E, et al. Chk1, but not Chk2 , is involved in the cellular response to DNA damaging agents: differential activity in cells expressing, or not, p53. Cell Cycle, 2004; 3:1177-1181

　　8 Jin ZH, Kurosu T, Yamaguchi M, et al. Hematopoietic cytokines enhance Chk1-dependent G2/M checkpoint activation by etoposide through the Akt/GSK3 pathway to inhibit apoptosis. Oncogene, 2005; 24: 1973-1981

　　9 Paddison PJ, Caudy AA, Hannon GJ. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:1443-1448