构建IL-2优化的免疫球蛋白抗淋巴瘤基因疫苗
作者：刘辉 常乃柏 顾惜春 朱平
【摘要】 本研究构建白介素2（IL-2）基因与免疫球蛋白重链可变区（IgHV）基因共表达的基因疫苗。从淋巴瘤患者外周血获得免疫球蛋白基因IgHV片段，将其与IL-2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体中。表达载体通过脂质体转染COS细胞， 用ELISA法检测IL-2的表达。结果显示：本研究成功构建了IgHV基因与IL-2基因的融合基因表达载体。在IgHV-IL-2/ pcDNA3.0中IL-2可以获得正确表达。结论： 本研究构建的IL-2和IgHV的融合表达载体可以在COS细胞中分泌表达IL-2。
【关键词】 基因疫苗 白介素2 淋巴瘤
Construction of Fusion Gene Between IgGHV and IL-2 as IgHV Nucleic Acid Vaccine Against Lymphoma
AbstractThe purpose of this study was to construct the IgHV and IL-2 coexpressed vector. The IgHV gene fragments were obtained from the peripheral blood of patients with lymphoma, and were cloned into eukaryotic expression vector. Meanwhile, the gene fragments of IgHV linked with gene of IL-2 were inserted into pcDNA3.0 to form a fusion gene of IgHV-IL-2. Then fusion genes were transfected into COS cells by Lipofectin and the expression of IL-2 was detected by ELISA. The results showed that the IgHV/pcDNA3.0 expression vector was successfully constructed. The 3′ end of IgHV was linked to IL-2 gene, and IL-2 could be correctly expressed. In conclusion, the expression vector of IgHV-IL-2 can express IL-2 correctly in COS cells.
Key wordsgene vaccine; IL-2; Lymphoma
在淋巴瘤的中放疗和化疗起着非常重要的作用，但放疗和化疗都伴有较严重的副作用，寻找副作用小并能根治淋巴瘤的方法一直是研究的热点，特异性免疫治疗的为淋巴瘤患者提供了希望。利用淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白独特型作为抗原制备的DNA疫苗能够诱导机体产生抗淋巴瘤的免疫反应。但DNA疫苗在体内不能自我复制，转化效率低，故DNA疫苗的免疫效率难以令人满意，寻找合适的免疫佐剂是增强基因疫苗免疫活性的重要手段。IL-2是一种重要的T细胞生长因子，在控制辅助T细胞的分化上起关键作用，能增强天然杀伤细胞（NK）,细胞毒T细胞（CTL）的功能，促进T细胞增殖和干扰素（IFN）的产生。给予抗原后注射IL-2可增强免疫反应，但细胞因子具有多效性，全身给予治疗量的细胞因子虽然可以增强免疫反应，但副作用较多。注射编码细胞因子的质粒可在免疫反应的局部持续释放低剂量的细胞因子，这样既可增强免疫反应，又能减轻毒性。因此构建IL-2和特定抗原的共表达载体可能是提高DNA疫苗效率的有效途径。报道，同时表达IL-2的DNA疫苗比不表达IL-2的疫苗免疫效应高出100倍［1］。为此，本研究克隆了免疫球蛋白重链可变区（IgHV）基因片段，构建IgHV与细胞因子IL-2的共表达载体，观察其在COS细胞中分泌表达IL-2。
材料和方法
IgHV真核表达载体的构建
从1例淋巴瘤患者外周血中构建免疫球蛋白基因IgHV克隆［2］，上游引物设计在IgHV的引导区内，5′ 端设计了Kozak序列及KpnI的酶切位点；下游引物设计在它的FR3区，5′ 端设计了终止密码子及EcoRI的酶切位点，序列如下（本实验所用引物均由上海博亚生物技术有限公司合成）：VH上: 5′-TAT AGGTACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3′，VH下：5′-TTAAGAATTCCTAAGTCGCACAGTAA TACACGGCCGT-3′。PCR反应按常规操作进行。PCR产物经KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0中。选取阳性克隆测序（上海博亚生物技术有限公司）。
IgHV和IL-2融合基因真核表达载体的构建
PCR获得3′端含接头（linker）的IgHV基因片段上游引物与VH上相同，下游引物在它的5′端设计了包含编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为接头，序列如下：VH下’:5′-AGAGCC TCCGCCACCGGATCCACCGCCACCAGTCGCACA GTAATACACGGCCGT-3′ 。
PCR获得5′ 端含linker的IL-2基因片段用PcD-hIL-2质粒（北京大学医学部免疫教研室马大龙教授惠赠）作为模板扩增hIL-2基因(399 bp)，在IL-2基因上游引物5′端设计了包含编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为接头，下游引物5’端设计了终止密码子及EcoRI的酶切位点，序列如下：hIL-2上：5′-GGTGGCGGTGGATCCGGTG GCGGAGGCTCTGCACCTACTTCAAGTTCTACAA AG-3′，h-IL-2下：5′-TTAAGAATTCCTAAGTTAGT GTTGAGATGATGC-3′ 。按常规进行PCR反应。将IgHV基因片段与IL-2基因片段经Klenow片段连接形成融合基因，定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0中构建IgHV和IL-2融合基因真核表达载体。选取阳性克隆测序（上海博亚生物技术有限公司）。将IgHV/pcDNA3.0和IgHV-IL-2/pcDNA 3.0在TOP10菌中大量扩增，用QIAgen Giga 无内热源质粒提取试剂盒大量提取质粒。
IL-2融合基因真核表达载体在细胞中的表达
通过脂质体介导法瞬时转染COS细胞（非洲绿猴肾细胞系），在6孔板上接种2×105 COS细胞（2 ml/well），37℃ CO2培养箱中培养24小时后每孔细胞贴壁约60％，细胞生长状态好。IgHV-IL-2/pcDNA 3.0各复种2孔，以pcDNA 3.0空质粒复种2孔作为阴性对照。按照Invitrogen公司提供的转染程序进行，脂质体Lipofectic∶DNA为3∶1（V/W）,导入外源DNA 2 μg/well。转染48小时后取培养上清，通过双抗体夹心ELISA法检测上清中的IL-2表达量。
结果
获得IgHV真核表达载体
所选择的淋巴瘤患者的外周血经PCR后获得其IgHV基因片段，长度约为350 bp左右，克隆后获得IgHV/ pcDNA3.0，经KpnI和EcoRI酶切之后出现预期条带，成功地构建了IgHV真核表达载体，基因序列如下：（略）注：黑框内的序列为ATG起始密码，下划线序列为终止密码。
获得IgHV和IL-2融合基因真核表达载体
经PCR获得在5′ 端包含编码10个氨基酸序列接头的IgHV片段，长度约380 bp左右；获得在3′ 端包含编码10个氨基酸序列接头的IL-2片段，片段长度为429 bp；将IgHV片段与IL-2片段连接后获得IgHV-IL-2融合基因片段，片段长度约800 bp，克隆后得到IgHV-IL-2/pcDNA3.0。表达载体质粒经KpnI和EcoRI酶切后出现预期条带（附图）。将融合基因质粒进行双向测序，结果显示融合基因序列完全正确，无移码突变和碱基错配。
IL-2融合基因真核表达载体在细胞中的表达
用ELISA检测了转染COS细胞48小时后培养上清中IL-2的表达量。结果表明，转染IgHV-IL-2/pcDNA3.0的培养上清中IL-2的表达量高于对照组空质粒pcDNA3.0 60倍以上（附表）。这说明IgHV-IL-2/pcDNA3.0可在体外暂时表达并分泌IL-2。
讨论
人们在对独特型疫苗的研究中发现，单纯的独特型疫苗仅能诱导出低度的抗独特型抗体，不足以激发抗肿瘤保护作用，这提示疫苗的免疫原性较弱，需要与免疫增强剂偶联。研究证实，IL-2、IL-4、GM-CSF、IL-1β、IP10、MCP-3等均有免疫增强的作用［3-6］。为了进一步增强细胞因子的免疫作用，Maecker等［4］将OVA基因与细胞因子共表达于同一载体质粒，质粒可以在体外表达OVA－细胞因子融合蛋白，后者注射给小鼠均能诱导出 OVA 较强的特异性细胞毒反应， 而且诱导出的免疫反应较分别注射 OVA 基因和细胞因子基因强。 因此， 为了加强免疫反应，我们将IL-2与IgHV3框架区基因构建于同一载体中，使细胞因子在最适的部位表达，从而高效地发挥其免疫增强作用，在构建IgHV-IL-2融合基因时，我们在引物中设计了包含编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列（Gly- Gly- Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- Gly-Ser）作为接头。甘氨酸结构简单，易于折叠，对融合蛋白的立体构象影响小，从而使表达的IgHV和hIL-2的空间构象尽量与天然产物相近，以保持其生物学活性。我们最终获得了IgHV、IgHV-IL-2表达载体。比较空质粒pcDNA3.0与融合基因克隆转染COS细胞后IL-2的表达量，发现融合基因表达载体能在真核细胞中有效表达并分泌IL-2。IL-2基因插入可能是增强DNA疫苗免疫效应的可行途径。
【】
1 Chow YH, Huang WL, Chi WK, et al. Improvement of hepatitis B virus DNA vaccine by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2. J Virol,1997; 71: 169-178
2 林宁晶,朱平,张新等. 组合免疫球蛋白基因片段诱发抗淋巴瘤的体液免疫反应. 中华医学杂志, 2002; 82: 766-770
3 Sun X, Hodge LM, Jones HP, et al. Co-expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor with antigen enhances humoral and tumor immunity after DNA vaccination. Vaccine, 2002; 20: 1466-1474
4 Maecker HT, Umetsu DT, DeKruyff RH, et al. DNA vaccination with cytokine fusion constructs biases the immune response to ovalbumin. Vaccine, 1997; 15: 1687-1696
5 Iwasaki A, Stiemholm BJ, Chan AK, et al. Enhanced CTL responses mediated by plasmid DNA immunogens encoding costimulatory molecules and cytokines. J Immunol, 1997; 158: 4591-4601
6 Burger JA, Mendoza RB, Kipps TJ. Plasmids encoding granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and CD154 enhance the immune response to genetic vaccines. Vaccine, 2001; 19: 2181-2189
