AML－1/ETO基因相关的AML－M2型白血病免疫表型分析
作者：张建军 杜欣 黄志新 苏健华 周茂华
【摘要】 本研究探讨AML/ETO基因重排的FAB分型为AML?M2患者的骨髓免疫表型的特征和预测性，以及与急性早幼粒白血病（APL）的区别。应用流式细胞术分析17例经荧光原位杂交（FISH）检测AML?1/ETO融合基因阳性、FAB分型为AML?M2（M2/ETO+）患者骨髓的免疫表型，并与34例AML?1/ETO阴性、FAB分型AML?M3、临床诊断为APL患者进行了比较。结果发现，17例M2/ETO+患者骨髓中均可见一群（15.89%-68.53%）原始细胞和一群SSC较高异质性的粒细胞。原始细胞表达干细胞相关抗原CD34、HLA?DR和髓系抗原CD33、CD13、MPO。在M2/ETO+患者中CD33表达强度显著低于APL患者（P<0.001），HLA?DR、CD19和CD34+CD56+共表达的阳性率均显著高于APL患者（P<0.001），而CD9的表达率则显著低于APL患者（P<0.001）。M2/ETO+患者粒细胞表达分化的髓系抗原CD11b和CD15，并可分为CD15+CD11b-和CD15+CD11b+两群，而成熟的粒细胞标志CD10均为阴性，与早幼粒细胞的表达图形相似。17例（100%）M2/ETO+患者的粒细胞均表达CD56，显著高于M3患者（6/34例，17.56%）。结论：AML?1/ETO基因重排的AML?M2型（FAB分型）白血病具有独特的免疫表型，对其基因重排有较高的预测性。应用多参数免疫分型技术可较容易地将M2/ETO+亚型白血病与APL鉴别。
【关键词】 AML－1/ETO融合基因；急性髓性白血病；AML?M2型白血病；免疫表型
Immunophenotypic Features of Acute Myeloid Leukemia with AML?1/ETO Fusion Gene
Abstract AML?1/ETO fusion gene is the frequent genetic lesion described in FBA M2 type acute myeloid leukemia (AML?M2) and is associated with a favourable prognosis. In spite of its potential clinical relevance, this subtype leukemia usually would be undetected with conventional cytology procedures, and easily confused with acute promyelocyte leukemia (APL) in morphology. In order to investigate the immunophenotypic characteristics of bone marrow cells in AML?M2 patients with AML?ETO gene rearrangement classified by FAB, immunophenotype of bone marrow cells in 17 AML?M2 patients with AML?1/ETO+confirmed by fluorescence in situ hybridization was analyzed by using flow cytometry as compared with immunophenotype in 34 APL patients with AML?1/ETO- . The results showed that population of blast cells (15.89%-68.53%) and population of more heterogeneous myeloid cells were detected with right?angle scatter in 17 patients with AML?1/ETO+, i.e. AML?M2 by FAB classification. The blast cells expressed stem cell associated antigens CD34, HLA?DR and myeloid antigens CD33, CD13, MPO. The mean fluorescent intensity of CD33 in M2/ETO+ patients was significantly lower than that in APL patients （121±92 vs 845±523，P<0.001）, meanwhile positive expression rates of HLA ?DR, CD19 and CD34+CD56+ in M2/ETO+ patients were significantly higher than that in APL patients (100%, 88.24%, 100% vs 27.27%, 8.82%, 0%, P<0.001), expression rate of CD9 in M2/ETO+ patients was significantly lower than that in APL patients (P<0.001). In patients with M2/ETO+ (AML?M2), the pattern of CD15/CD11b expression was seen as granulocytic differentiation with immature events showing CD15+CD11b- and more mature CD15+CD11b+ populations, the expression of mature granulocytes CD10 was negative and smilar to APL in expression figure. The granulocytes expressed CD56 in 17 patients with M2/ETO+ (17/17, 100%) and its expression rate was significantly higher than that in patients with M3 (6/34, 17.56%). It is concluded that AML?M2 with AML?1/ETO gene rearrangement was confirmed to express an exclusive immunophenotype that shows highly predictive value for the cytogenetic pattern, and the multiparametric flow cytometry with FISH provides a technical approach to easily distinguish leukemia subtype AML1/ETO基因相关的AML?M2型白血病免疫表型分析 AML?1/ETO融合基因是由染色体t（8；21）（q22；q22）易位累及21号染色体的急性髓系白血病基因1（AML?1）和8号染色体的ETO（eight twenty one）基因，结果形成AML?1/ETO融合基因［1］。AML?1/ETO融合基因是急性髓系白血病（AML）中常见的染色体畸变之一，最常见于AML?M2型［2］。AML/ETO基因重排的AML?M2（M2/ETO+）白血病在临床和形态学上常易与APL混淆，造成误诊和的错误。本研究应用多参数流式细胞技术对17例M2/ETO+患者和34例APL患者骨髓进行多参数免疫表型分析，探讨M2/ETO+亚型白血病免疫表型的特征和预测性，以及与APL的区别。
材料和方法
病例
2003年1月至2005年12月在我院住院的17例经荧光原位杂交（FISH）检测AML?1/ETO阳性，按FAB分型为AML?M2的患者，其中男8例，女9例，中位年龄32（8-67）岁。34例按FAB分型为M3，男20例，女11例，中位年龄30（2-66）岁，FISH检测AML?1/ETO阴性，其中18例PML/RARα阳性。其余16例虽然PML/RARα检测阴性，但临床使用反维甲酸治疗效果显著。
试剂
单克隆抗体组合：CD71?FITC/CD33?PE/CD45?PreCP，CD15?FITC/CD11b?PE/CD45?PreCP，CD19?FITC/CD10?PE/CD45?PreCP,CD7?FITC/HLADR?PE/ CD45? PreCP，CD14?FITC/CD13?PE/CD45?PreCP，CD34?FITC/CD56?PE/CD45?PreCP，MPO?FITC/CD9? PE/CD45?PreCP。所有抗体、透膜剂和裂解液购自美国Becton Dickinson公司。双色双融合AML?1/ETO和PML/RARα探针试剂盒购自美国V/sis公司。
仪器
FACSCalibur 流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），氩离子激光，功率15 mW，激发光源波长为488 nm。荧光显微镜（Nikon）。MACPROBEVA 2.3 FISH图象分析系统。
形态学检查
全部病例均经血象检查、骨髓形态学观察。血片与骨髓涂片经瑞氏染色，按血液学常规进行分型。
AML?1/ETO融合基因检测
取EDTA三钾抗凝骨髓2 ml，用0.075 mol/L KCl低渗和甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定提取骨髓单个核细胞，用AML?1/ETO和PML/RARα探针进行荧光原位杂交，然后用荧光显微镜和FISH图象分析系统进行结果分析。每例数200-500个细胞，出阳性细胞百分数。核型异常识别参照ISCN（1995）国际体系。
免疫表型分析
使用全血三色直接免疫荧光标记法进行染色。取EDTA三钾抗凝骨髓50 μl注入试管里，加入FITC、PE和PreCP标记的单克隆抗体，充分混合，放置室温避光孵育30分钟。加入红细胞裂解液1ml，在室温下放置5-10分钟。200×g离心5分钟，去掉上清液，用PBS洗涤1次，加入0.5 ml 1%多聚甲醛缓冲液固定。胞浆内MPO的染色首先标记表面抗体，加入裂解固定液，离心去掉上清，加入0.5 ml透膜剂10分钟，以含1% FBS的PBS洗涤1次，加入MPO-FITC抗体孵育30分钟，用1% FBS的 PBS洗涤，流式细胞仪检测。每次检测前先用CaliBRITE beads ３校准仪器。然后用 CellQuest软件获取10 000细胞，用CD45/SSC设门识别白血病细胞群和各有核细胞群，分析白血病细胞群在各种分化抗原的表达情况和图形。
统计学处理
应用SPSS 13.0软件，用Chi-square test 和Student test对M2/ETO+患者和APL患者各免疫表型的表达率和白血病细胞阳性百分数进行统计学分析，P＜0.05为显著差异。
结 果
形态学
17例AML?1/ETO阳性患者形态学诊断为AML?M2（FAB分型）。原始细胞分别由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型原粒细胞组成，易见奥氏小体，部分可见较粗大嗜天青颗粒，过氧化物酶和AS-D奈酚脂酶染色可见条索状或团块状阳性分布。34例APL，原始细胞少见，颗粒过多的异常早幼粒细胞大于20%，胞体不规则，可见多条奥氏小体，过氧化物酶和特异性酯酶呈强阳性。
AML?1/ETO融合基因
17例AML-M2患者AML?1/ETO融合基因检测结果均为阳性，阳性细胞数为56%-93%，平均76%。34例APL患者AML?1/ETO融合基因检测结果均为阴性，但其中18例PML/RARα阳性。阳性细胞数为33%-96%，平均80%。其余16例PML/RARα检测阴性。
免疫表型
17例M2/ETO+患者骨髓的CD45/SSC图中均可见一群原始细胞，含量在15.89%-68.53%和一群SSC异质性较高的粒细胞（附图A），存在成熟的淋巴细胞，但非常少，甚至无单核细胞存在。原始细胞表达干细胞相关抗原CD34、HLA?DR和髓系抗原CD33、CD13、MPO（附表）。17例（100%）M2/ETO+患者CD34和HLA?DR均阳性，显著高于APL患者的20.59%（7/34）和27.27%（9/33）；而CD33、CD13和MPO的阳性率和阳性细胞数与APL患者比较均无显著差异，但M2/ETO+患者CD33的平均荧光强度显著低于 APL 患者 （121±92 vs 845±523， P<0.001）（附图B）。在M2/ETO+患者中，原始细胞MPO的表达强度弱于自身的粒细胞。
在本研究17例M2/ETO+患者中有15例（88.24%）患者原始细胞表达CD19（附图C），而34例APL患者只有3例（8.82%）CD19阳性，两者比较存在显著的差异（P<0.001）。M2/ETO+患者CD19阳性细胞数为5.83%-35.55%，并且CD19表达的荧光强度常比骨髓中自身的B淋巴细胞弱，部分常被有核细胞的非特异荧光所掩盖。两组共18例CD19+的患者均接受了CytoCD79a，CD22和CD20等其他B淋巴细胞标志检测，结果表明，其他B淋巴细胞标志均为阴性，而MPO阳性。同时，17例M2/ETO+患者中全部（100%）检测到一群CD34+CD56+共表达的原始细胞（附图D），含量为1.02%-51.92%；而34例APL患者有7例（20.59%）检测到CD34+细胞，但无1例检测到CD34+CD56+共表达的细胞。M2/ETO+患者CD9的阳性率只有12.5%（1/8），显著低于APL患者的93.75%（30/32）（P＜0.001）。
另外，在免疫表型的图形中可见到M2/ETO+患者粒细胞存在异常的分化过程。粒细胞可分为CD15+CD11b-和CD15+CD11b+ 两群（附图E），而CD10这一粒细胞成熟的标志均为阴性。M2/ETO+粒细胞这些表达模式与早幼粒细胞相似。17例M2/ETO+患者中粒细胞均表达CD56（100%，17/17），显著高于APL患者（17.56%，6/34）。
讨 论
AML?1/ETO融合基因见于t（8；21）（q22；q22）易位患者，在AML中检出率为20%左右，在AML?M2中检出率约为40%，在M2b的形态学表型中检出率高达80%-90%，偶见于M1、M4和M5型白血病［2-4］。本研究17例AML?1/ETO融合基因阳性的患者形态学诊断均为AML?M2b型白血病。M2b型白血病是1986年全国白血病分型分类会议套用FAB分类方法列出的，也有称之为中幼粒或亚急性粒细胞白血病。但是FAB协作组的分型中无此亚型。从形态学看存在此型白血病，骨髓常见原始细胞、早幼粒细胞和中幼粒细胞增生活跃，并以异常中幼粒细胞增多最为显著。由于此型白血病形态学上的表现较易与APL混淆，若能在免疫分型诊断找出其特征将有助于及早并准确地诊断。
M2/ETO+白血病骨髓主要存在原始细胞和异常的早幼、中幼粒细胞。本研究17例M2/ETO+患者骨髓免疫分型结果可见到15.89%-68.53%表达CD34和HLA?DR干细胞抗原的原始细胞和一群SSC异质性较高，表达CD15和CD11b抗原，但不成熟（CD10阴性）的粒细胞。此结果与Andrieu［2］ 和Kita等［5］报道一致。 这个结果说明，M2/ETO+型白血病不仅在形态学，而且在免疫表型都是由异质的、分化的粒细胞组成，同时也显示了M2/ETO+型白血病在免疫表型分析中存在原始细胞和早幼、中幼粒细胞共存的特征。 CD33是早期髓系重要的标志，它通常在AML细胞表达。但在M2/ETO+型白血病中，CD33表达强度显著下降［2,5］。本研究的结果也显示M2/ETO+AML细胞CD33平均荧光强度显著低于APL和自身的粒细胞。Kita等［5］认为，这个表型异常的表达反映了M2/ETO+白血病存在髓系抗原基因表达的异常调节。
本研究显示，CD19和CD56这两个非髓系抗原在M2/ETO+原始细胞表达频率显著增高，而这些病例胞内CD79a和其他B细胞标志均阴性，MPO阳性。此结果说明M2/ETO+存在高频率的系列交叉表达。什么原因引起这一现象，目前仍不清楚。有人认为，这是谱系失真（lineage infidelity）［6］或系列混合性［7］所造成的。从本研究的结果可看到APL也有部分病例表达CD19或CD56，但却没有1例共表达CD19+CD56+和共表达CD34+CD56+的。而在17例M2/ETO+中有15例共表达CD19+CD56+，17例共表达CD34+CD56+。由此可见，共表达CD19、CD56和CD34是M2/ETO+白血病的特征。
综上所述，虽然CD34、CD33、HLA?DR、CD19和CD56的表达都不是M2/ETO+白血病特异的指标，但是通过多参数免疫分型综合分析可以看到M2/ETO+白血病具有独特免疫分型图象，对其基因重排有较高的预测性，并且应用多参数免疫分型技术可较容易地将M2/ETO+型白血病与APL鉴别。
【】
1Nucifora G, Birn DJ, Erickson P, et al. Detection of DNA rearrangements in the MAL1 and ETO loci and of an AML1/ETO fusion mNRA in patient with t(8;21) acute myeloid leukemia. Blood, 1993; 81:883-888
2Andrieu V, Radford?Weiss I, Troussard X, et al. Molecular detection of t(8;21)/AML1?ETO in AML M1/M2: correlation with cytogenetics, morphology and immunophenotype. Br J Haematol, 1996; 92:855-865
3Cho EK, Bang SM, Ahn JY, et al. Prognostic value of AML1/ETO fusion transcripts in patients with acute myelogenous leukemia. Korean J Intern Med, 2003; 18:13-20
4卢兴国. 造血和淋巴组织肿瘤诊断学. 北京: 出版社.2005: 209-313
5Kita K, Nakase K, Miwa H, et al. Phenotypical characteristics of acute myelocytic leukemia associated with the t(8;21) (q22;q22) chromosomal abnormality: frequent expression of immature B?cell antigen CD19 together with stem cell antigen CD34. Blood, 1992; 80:470-477.
6Smith LJ, Curtis JE, Messner HA, et al. Lineage infidelity in acute leukemia. Blood , 1983, 61:1138-1145
7Greaves MF, Chan LC, Furley AJ, et al. Lineage promiscuity in hematopoietic differentiation and leukemia. Blood, 1986; 67:1-11
