Graves病伴血细胞减少症患者外周血淋巴细胞的研究

【摘要】  　　为了研究Graves病伴血细胞减少症患者外周血淋巴细胞的变化，探讨Graves病伴血细胞减少症的发病机制，以流式细胞术测定24例患者外周血Th细胞亚群及CD5+B淋巴细胞的数量、B淋巴细胞胞浆内凋亡蛋白Bcl?2的表达水平，并与18名正常人作对照。结果表明：正常对照组Th1细胞和Th2细胞百分率、 Th2/Th1 比值、CD5+B细胞百分率、Bcl?2表达率分别是(0.39±0.24)%、（0.28±0.15）%、 （0.52±0.12）%、（7.89±0.38）%、（36.49±6.79)%；患者组Th1细胞和Th2细胞百分率、Th2/Th1 比值、CD5+B细胞百分率、Bcl?2表达率分别是(0.81±0.45)%、（ 6.83±3.02）%、（20.55 ±6.15）%、（20.89±1.62）%、（80.25±15.56)%，均显著多于正常人对照（ P<0.05, P<0.01, P<0.01,P<0.05 ,P<0.05）。结论：Graves病伴血细胞减少症发病可能与Th1/Th2 比例失衡，Th2细胞增多，导致CD5+B细胞数量上升及凋亡减低，自身抗体的产生增加有关。

【关键词】  Graves病; 血细胞减少; 淋巴细胞; 免疫; 细胞凋亡

　　 Lymphocyte Changes in  Patients with  Graves's Disease Accompanied by  Hematocytopenia

      Abstract    The aim of study was to investigate  the lymphocyte changes in peripheral blood of patients with Graves's disease accompanied by hematocytopenia  and to explore its pathogenesis.   The quantity and ratio of Th2、Th1 、CD5+B 、Bcl?2 level  in 24  Graves's disease patients   with hematocytopenia were detected by FACS, and 18  adults were selected as normal controls.  The results indicaled that the percentages of Th1, Th2, ratio of Th2/Th1, CD5+B, Bcl?2 leve  in peripheral blood of the patients were( 0.81±0.45)%, (6.83±3.02)%,( 20.55 ±6.15)%, (20.89±1.62)%, (80.25±15.56)%,  respectively,  and were  higher than those of normal controls［(0.39±0.24)% (P<0.05),( 0.28±0.15) % (P<0.01) , ( 0.52±0.12)% (P<0.01) , (7.89±0.38) % (P<0.05) ,(36.49±6.79) % (P<0.05)］. It is  concluded that the  pathogenesis of Graves's disease with hematocytopenia may be related to unbalance of Th1/Th2,  increase of Th2  inducing   over?expression of  CD5+B and  Bcl?2  on B cell.

    Key words    Graves's disease;  hematocytopenia;  lymphocyte;  immune;  apoptosis

    Graves病由Parry于1825年首次报告，是甲状腺功能亢进症的最常见病因，主要表现为甲状腺毒症、弥漫性甲状腺肿、眼征和胫前黏液水肿。目前公认Graves病的发生与自身免疫有关，属于自身特异性自身免疫病，即抗体介导的免疫反应性疾病，临床上经常与血细胞减少症并存，说明两者之间可能存在同样的发病机制，或就是一种疾病的不同阶段的不同组织受累的表现。为探讨其发病机制，我们检测24例Graves病伴血细胞减少症患者的外周血淋巴细胞的变化，并与18名正常人进行了对照，兹报告如下。

    材料和方法

    病例

    24 例Graves病患者，均为2004年8月至2005年12月在我院门诊及住院的患者，男5例，女19例，年龄16-56岁，平均年龄38.5岁。24例患者均同时符合以下标准：①高代谢症状和体征；②弥漫性甲状腺肿大伴或不伴血管杂音；③血清FT4增高，TSH减低。初诊时血常规检测中仅伴血小板减少者 10 例， 其Plt值（10-78）×109/L；血小板及白细胞均减少9例，其Plt值（30-60）×109/L，WBC值（1.23-3.78）×109/L；全血细胞减少5例，WBC值（2.3-2.58）×109/L，Hb值(70-85)g/L,Plt值（57-70）×109/L。18名正常对照者中，男5例，女13例，年龄18-58岁，平均年龄40.1岁。

    试剂

    所用鼠抗人CD4、IFN?γ、IL?4、CD5 、Bcl?2单克隆抗体和鼠抗人CD19单抗克隆抗体均购自美国Ancell生物制剂公司，牛血清白蛋白和RPMI 1640购自深圳晶美公司，聚甲基丙烯酸、依若霉素、莫能霉素及皂素购于美国Sigma公司。流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。

    外周血单个核细胞分离

    采集患者及正常对照者的外周血4 ml,以5íTA抗凝，800 r/min离心10分钟，去上清，加入细胞培养液RPMI 1640至4 ml，混匀，用PBS等量稀释后分装于2个离心管中，用Ficoll淋巴细胞分离液（密度1.077)分离单个核细胞。

    细胞培养及细胞因子分泌抑制

    细胞按5×105 /ml的浓度培养，并加入PMA和依若霉素以扩大原有细胞因子的产量，用莫能霉素抑制高尔基体对细胞因子的转运。基本培养基为IMDM，体系如下：10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、50     μg/ml青霉素、50 μg/ml链霉素、50 ng/ml PMA、250 ng/ml依若霉素、140 ng/ml莫能霉素。细胞与培养液混合后加入到24孔板中，在37℃、95%湿度、5% CO2培养箱内培养5小时。

    荧光染色

    用结合异硫氢酸荧光素（FITC）的鼠抗人CD4单克隆抗体直接标记细胞膜CD4，用结合藻红蛋白荧光素的鼠抗人IFN?γ、IL?4单克隆抗体直接标记细胞浆内的IFN?γ、IL?4，Th1细胞为CD4+、IFN?γ+，Th2细胞为CD4+、IL?4+。

    CD19+CD5+细胞测定

    试管中加入鼠抗人CD19?FITC和鼠抗人CD5?PE各20  μl,再加入单个核细胞悬液100 μl，混匀，4℃避光孵育40分钟，PBS液洗2遍，加入10 g/L的多聚甲醛固定液200 μl ，混匀，4℃固定30分钟。对照管中加入鼠抗人CD19?FITC和鼠抗人IgG1?PE各20 μl，按上述方法操作。最后用流式细胞术测定CD19+CD5+细胞，CD19+CD5+ /CD19+的表达率。

    B淋巴细胞胞浆内Bcl?2表达测定

    加入鼠抗人CD19?FITC 20  μl, 单个核细胞悬液100 μl ，4℃避光孵育30分钟 ，用PBS液洗2遍，加入1%的多聚甲醛固定液1 ml，混匀，在4℃条件固定15分钟，各加入含1 g/L皂素的PBS 1 ml，室温孵育60分钟，用PBS液洗2遍。在试验管中加入鼠抗人Bcl?2?PE单克隆抗体各20 μl。 对照管中加入同型不相关鼠抗人IgG1?PE单克隆抗体各20 μl ，4℃避光孵育40分钟，用PBS液洗3遍，然后加入1%的多聚甲醛固定液200 μl ，混匀，4℃固定30分钟。流式细胞术测定CD19+细胞胞浆内Bcl?2表达率。用流式细胞仪（FACS Vantage Becton Dickinson公司产品）进行细胞测定，用cell Quest 3.1获取和分析细胞。

    统计学分析

    使用SPSS 10.0软件分析，结果以均值±标准差（±SD）表示，计量资料的比较用t检验。

    结    果

    CD4+IFN?γ+ 、CD4+IL?4+细胞的检测

    患者组CD4+IFN?γ+ 和CD4+、IL?4+细胞百分率增加（0.812±0.45），显著和高于正常对照组（0.39±0.24），（P<0.05）,且CD4+IL?4+升高更为显著（P<0.01）；患者组CD4+IL?4+ / CD4+IFN?γ+比值为20.55 ±6.15，而正常对照组0.52±0.12（P<0.01），提示CD4+IFN?γ+ / CD4+IL?4+比例失衡，尽管CD4+IFN?γ+细胞相应增加，仍未能使之平衡（图1、附表）。

    患者组外周血 CD5+ CD19+ 细胞占 CD19+ 细胞的比例为（20.89±1.62）%，正常对照组为（7.89±0.38）%，患者组明显高于正常对照，差异有显著性（P<0.05）。患者组CD5+ CD19+细胞中位荧光强度(20.6±2.74)%,明显高于正常对照(9.78 ±1.55)%,差异有显著性（P<0.05）。患者组CD19+ Bcl?2+细胞胞占CD19+细胞的（80.25±15.56）%，正常对照组（36.49±6.79）%，患者明显高于后者，差异有显著性（P<0.05）。Bcl?2+CD19+ 细胞中位荧光强度(79.8%±11.23),明显高于正常对照(35.2 ±4.47)%,差异有显著性（P<0.05）（附表、图2）。

     讨    论

    研究表明，Th对体液免疫及细胞免疫均有调节作用，根据产生细胞因子的不同分为Th1细胞和Th2细胞［1］。Th1细胞主要分泌IFN?γ、IL?2等；Th2细胞主要分泌IL?4、IL?10、IL?5、IL?13等。Th1细胞因子主要参与造血负调控，Th2细胞因子尤其IL?4、IL?10可促进B淋巴细胞生长、增殖和分化为浆细胞，从而产生大量的IgM、IgG和IgA抗体。Villasenor等［2］发现，IL?10还可通过促进抗凋亡蛋白Bcl?2的表达，延长B淋巴细胞的生存时间而促进抗体的分泌。近年来提出的免疫相关性血细胞减少症发病［3,4］主要与Th1/Th2失衡、向Th2 细胞偏移、在Th2 细胞因子作用下B细胞数量和功能异常有关，并进而产生抗骨髓未成熟造血细胞自身抗体破坏和抑制造血细胞，导致血细胞减少。

    近年的研究发现，Graves病免疫反应是通过抗原单独与B细胞结合启动B细胞抗体而产生，Ts细胞调节失控，可导致针对甲状腺抗原的B细胞和自身抗体增高［5］。对Graves病患者外周血T淋巴细胞的研究时发现，CD8+细胞比例下降，CD4+/CD8+比值升高，且白细胞介素能刺激抗原激活的B细胞活性及凋亡减弱。

    临床上Graves病和血细胞减少症同时发生，可能存在共同的发病机制，即T、B淋巴细胞异常，B细胞在Th作用下产生了抗甲状腺、白细胞、红细胞及血小板的抗体，引起内分泌和血液系统的病变。我们检测24例Graves病伴血细胞减少症患者外周血Th1（CD4+IFN?γ+）、Th2（CD++IL?4+）细胞，它们显著高于正常对照组，（P<0.05）,且Th2细胞升高更为显著（P<0.01）；患者组CD5+ CD19+细胞为（20.89±1.62）%，正常对照组为（7.89±0.38）%，前者明显高于后者，差异有显著性（P<0.05）。已知CD5+细胞可分泌多种自身抗体，导致病理性的自身抗体诱导的自身免疫性疾病的产生。研究发现，在多种自身免疫性疾病中如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等，CD5+细胞的数量均有明显上升［6,7］，推测其在自身免疫疾病中发挥着作用。免疫细胞凋亡异常在多种自身免疫系统疾病中有重要作用，Bcl?2过度表达，可造成淋巴细胞凋亡减低，前B细胞或B细胞寿命延长，多种自身抗体及高γ球蛋白血症出现。我们检测24例患者Bcl?2+细胞阳性率明显高于正常对照，差异有显著性（P<0.05）。24例患者常规检测血小板相关抗体（PAIg）、甲状腺受体抗体（TRAb）Ig（A+M+G），分别为（90%  vs  12%, 85%  vs  2%,60%  vs  17%），较正常对照显著升高(P<0.01)。我们检测结果与［3,4］相符，说明Graves病伴血细胞减少为免疫相关性血细胞减少症。

    另外，我们发现3例患者先后在发现血细胞减少3、5、11个月时诊断Graves病。有2例患者我们在单用CsA血细胞减少时TRAb 亦随之下降，甲状腺功能亢进症状好转；CsA能抑制IL?2产生，纠正Th1/Th2失衡。由此提示：Graves病伴血细胞减少症是否为一种自身免疫系统疾病不同阶段的不同组织受累的表现呢？

    深入研究Graves病伴血细胞减少症的发病机制，对更好地同时治疗内分泌及血液系统的病变有重要意义。

【文献】
  1Mosmann TR,Cherwinski H,Bond MW, et al.Two type of murine helper T cell clone .Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol,1986; 136: 2348-2357

2Villasenor?Bustamante S, Alvarado?De?La?Barrera C, Richaud?Patin Y, et al. Possible role of interleukin?10 in autoantibody production and in the fate of human cord blood CD5+B lymphocytes. Scand J Immunol,1999; 49: 629-632

3付蓉，邵宗鸿，刘鸿等.免疫相关全血细胞减少患者骨髓造血祖细胞增殖功能及辅助性T淋巴细胞功能观察.中华血液学杂志，2004; 25: 213-216

4付蓉，邵宗鸿，刘鸿等.免疫相关性全血细胞减少患者骨髓B淋巴细胞数量及凋亡相关蛋白水平. 中华血液学杂志，2002; 23: 236-238

5Ishikawa N, Eguchi K, Otsubo T, et al. Reduction in suppressor?inducer T cell subset in thyroid tissue from patients with Graves's disease. J Clin Endocrinol Metab,1987; 65: 17-23

6Youinou P, Lydyard PM.CD5+ B cells in nonorgan?specific autoimmune diseases :a fresh look. Lupus,2001; 10:523-525

7Seidi OA, Semra YK, Sharief MK. Expression of CD5 on B lymphocytes correlates with disease activity in patients with multiple sclerosis. J Neruoimmunol, 2002; 133:205-210?