ERK和P38信号转导途径对慢性髓系白血病细胞周期的调控作用

             作者：郭晓　潘崚　侯兰芬　王友君　郭宏谋　杨琳　王志伟　孙宇　李栋梁

【摘要】  　　本研究探讨ERK和P38信号转导途径对慢性髓系白血病（CML）细胞周期的调控作用。以RT?PCR、Western blot和FCM方法分别检测CML患者白血病细胞和K562细胞中ERK、p38、cyclin D2、cyclin E、p27的mRNA表达及蛋白表达（其中ERK和P38为磷酸化ERK和磷酸化P38）及细胞周期分布，并分析其相关关系。结果表明： CML患者白血病细胞和K562细胞中ERK、P38、cyclin D2、cyclin E的mRNA表达和蛋白表达增高，P27的表达降低，且cyclin D2 蛋白表达与cyclin E、ERK和P38蛋白表达呈正相关(P<0.01)，与P27蛋白表达呈负相关(P<0.01)。 G0/G1期细胞减少，S期细胞增多，与对照组相比有显著性差异。结论： CML中P38、ERK mRNA表达和活性增加，激活下游的cyclin D2 、cyclin E和P27等细胞周期调控因子，致使G0/G1期缩短，细胞快速通过G1/S转换点进入S期，加速细胞周期进程和细胞增殖，导致CML的发生。

【关键词】  ERK信号转导途径　 P38信号转染途径； 信号转导途径； 慢性髓系白血病

　　 Regulative Effects  of ERK and P38 Signal Transduction Pathway on Cell Cycle in Chronic Myeloid Leukemia

    Abstract    This study was aimed to investigate  the regulative effect  of ERK and p38 signal transduction pathway on cell cycle of CML. The mRNA and protein expression  of ERK, p38,cyclin D2, cyclin E and p27 (ERK and p38 were Phosph?ERK and Phosph?P38)    in CML cells and K562 cell lines were detected by RT?PCR and Western blot, respectively;  cell cycle was determined by FCM, and their relationship was analyzed.  The results showed that the mRNA and protein expressions  of ERK, p38,cyclin D2 and cyclin E in CML cells and K562 cells increased (P<0.01) and the expression of p27 decreased (P<0.01). There was positive correlation between the protein expressions of cyclin D2 and the protein expreesion of  ERK， p38 and cyclin E, but there was  negative  correlation between the protein  expressions of cyclin D2 and the protein expression of  p27. The percentage of cells in G0/G1 phase was decreased and the  percentage of cells  in S phase  was increased, there was significant difference as compared with control (P<0.05). It is concluded that  increase of  the mRNA expression  and protein activity of ERK and  p38  activate the  cell cycle?regulating proteins such as cyclin D2 ,cyclin E,p27  which results in   shortening of G0/G1 phase,  switching cell to S phase through G1/S check point quickly and  accelerating  cell cycle progression and cell proliferation, and  eventually  leads to occurence of CML.

    Key words    ERK signal transduction pathway; P38 signal transduction pathway; signaling transduction pathway;    chronic myeloid   leukemia

    慢性髓系白血病(CML)的分子生物学特点是存在bcr/abl融合基因，表达具有高酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白，它通过相关信号转导途径，影响下游的细胞周期调控分子的表达水平，进而扰乱细胞周期，与白血病细胞恶性生长和增殖有密切关系［1］。

    Cyclin D2、cyclin E和P27是BCR/ABL通过相关信号转导途径调节细胞周期的重要靶蛋白，但其具体作用机制不清。本研究拟对CML细胞中cyclin D2、cyclin E和p27的表达状况及其与丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径的信号分子磷酸化p38、ERK表达的相互关系进行研究，以求进一步揭示ERK和p38信号转导途径对慢性粒细胞性白血病细胞周期的调控作用，为CML临床的进一步探讨提供初步的理论基础。

    临床资料

    30例BCR/ABL阳性的CML慢性期患者，均按国内标准［1］、经临床血液学及细胞遗传学、分子生物学检查确诊。30例中，男性19例，女性11例，中位年龄47（38-64）岁。初治21例，曾用羟基脲、干扰素治疗9例（治疗最长7年，最短1月）；另选20例健康人，作为正常对照，其中男性11例，女性9例，中位年龄38（26-60）岁。

    临床标本和细胞培养

    分别抽取患者和健康人新鲜骨髓5 ml，肝素抗凝，制作6张骨髓片，其余骨髓加等量PBS稀释，用Ficoll淋巴细胞分离液（密度1.077）分离单个核细胞。获取的单个核细胞直接用于实验检测或保存于-80℃冰箱备用。 K562细胞株由本院中心实验室提供，置于含有15%小牛血清的RPMI  1640培养液中，在37℃、 5% CO2、饱和湿度的恒温孵育箱中培养，采用对数生长期细胞进行实验。

    细胞周期的流式细胞术检测

    分别取CML患者、健康人的骨髓单个核细胞和K562细胞各5×106个， 用PBS洗3遍，所得细胞用70%乙醇固定，不含DNA酶的RNA酶处理，碘化丙锭（PI）染色后进行流式细胞仪检测，并对获取数据进行细胞周期分析。

    各组细胞中相关蛋白表达水平的Western blot检测

    分别取CML患者、健康人的骨髓单个核细胞和K562细胞各5×106个，加入1 ml蛋白裂解液(50 mmol/L Tris?HCl pH=8.0、150 mmol/L NaCl、100 mg/L PMSF、1 mg/L  aprotinin、1% NP?40、0.1% SDS)，充分裂解，直至裂解液完全澄清。用Bradford法测定样品中的蛋白含量，将所有样品的蛋白含量稀释至等浓度（5 μg/μl）。取10 μl蛋白样品与10 μl上样液混匀，沸水浴5分钟，上样至5%浓缩胶和10%分离胶的SDS－PAGE，100 V电泳约4小时。电泳完毕，将凝胶中的蛋白条带电转移至硝酸纤维素膜，100 mA约3小时，硝酸纤维素膜置于封闭液中，4℃过夜。次日，加入一抗（兔抗鼠磷酸化ERK单克隆抗体或兔抗鼠磷酸化P38多克隆抗体或兔抗鼠cyclin D2或兔抗鼠P27或鼠抗人cyclin E或β?actin单克隆抗体）；然后再加入生物素化二抗（vector），碱性磷酸酯酶联生物素亲和素（vector），分别摇床震荡1.5小时，充分反应，使之互相结合，最后加入显色底物NBT?BCIP，在酶催化作用下，显色于硝酸纤维素膜。通过Quantity One软件对各组条带扫描，并对其光密度值进行半定量分析。

    各组细胞中相关基因表达水平的RT?PCR检测

    统计学处理

    所有半定量检测实验均重复3次，数据以±SD表示。以SPSS 11.0软件的t检验和χ2检验，以及Pearson相关性分析，对数据进行统计学处理，P<0.05表示具有统计学的显著差异。

    结    果

    各组基因在原代CML细胞、K562细胞株和健康人骨髓单个核细胞中的表达

    对照组20例健康人骨髓单个核细胞中cyclin D2基因的检出阳性率为15.0% ，表达水平为0.31±0.09；p27基因的检出阳性率为55.0%，表达水平为0.86±0.18; cyclin E基因的检出阳性率为20.0%，表达水平为0.43±0.10; ERK基因的阳性率为30.0%，表达水平为0.28±0.07； p38基因的检出阳性率为35.0%，表达水平为0.36±0.11。在原代CML细胞中cyclin D2基因的检出阳性率为46.7%,表达水平为0.67±0.12； p27基因的检出阳性率为23.3%，表达水平为0.9±0.11； cyclin E基因的检出阳性率为73.3%，表达水平为0.92±0.15；ERK基因的阳性率为56.7%，表达水平为0.51±0.13; p38基因的检出阳性率为66.7%，表达水平为0.60±0.16。与健康人骨髓单个核细胞相比，cyclin D2、cyclin E、ERK、p38 mRNA的表达水平和检出阳性率都有不同程度的升高；p27 mRNA的表达水平和检出阳性率则有所下降，经统计学处理均有非常显著性差异（P<0.01)。K562细胞中各相关基因的表达水平与CML细胞类cyclin D2的表达水平为0.60±0.05,p27的表达水平为0.36±0.05, cyclin E的表达水平为0.87±0.06, ERK的表达水平为0.55±0.04; p38的表达水平为0.64±0.05。K562细胞与原代CML细胞比较各基因表达均无显著性差异（P>0.05)（图1、图2、表1）。

    各组蛋白在原代CML细胞、K562细胞株和健康人骨髓单个核细胞中表达的Western?blot检测

    对照组健康人骨髓单个核细胞中Cyclin D2蛋白的

    检出阳性率为13.3%，表达水平为0.52±0.19; p27蛋白的检出阳性率为63.3% ，表达水平为0.76±0.16；Cyclin E蛋白的检出阳性率为23.3%，表达水平为0.31±0.04;磷酸化ERK（P?ERK）蛋白的阳性率为26.7%，表达水平为0.25±0.13；磷酸化P38（P?P38）蛋白的检出阳性率为33.3%，表达水平为0.41±0.17。在原代CML细胞中，Cyclin D2蛋白的检出阳性率为50.0%，表达水平为0.94±0.22；P27蛋白的检出阳性率为23.3%，表达水平为0.32±0.21; cyclin E蛋白的检出阳性率为76.7%，表达水平为0.81±0.18; P?ERK蛋白的阳性率为Table 1.  Expression of cyclin D2, cyclin E, P27,ERK, and P38 mRNA in CML cells of 30 patients, K562 cells   and  cells of 20 normal controls (±SD)

     60.0%，表达水平为0.55±0.17；P?P38蛋白的检出阳性率为66.7%，表达水平为0.74±0.22。与健康人骨髓单个核细胞相比，cyclin D2、cyclin E、P?ERK、P?P38蛋白的表达水平和检出阳性率都有不同程度的上升；P27蛋白的表达水平和检出阳性率则有所下降。经统计学处理均有显著性差异（P<0.05）。且cyclin D2蛋白表达与P?ERK、P?P38、cyclin E蛋白的表达呈正相关（相关系数分别为0.959,0.962,0.974 P<0.01)。与P27蛋白表达呈负相关（相关系数为-0.990, P<0.01)。K562细胞中各相关蛋白的表达水平与CML细胞类似，cyclin D2的表达水平为0.60±0.05；P27的表达水平为0.36±0.05；Cyclin E的表达水平为0.87士0.06；P?ERK的表达水平为0.55±0.04；P?P38的表达水平为0.64±0.05。K562细胞与原代CML细胞比较各蛋白表达均无显著性差异(P＞0.05)（图3、图4，表2、表3）。

    原代CML细胞、K562细胞和健康人骨髓单个核细胞的细胞周期流式细胞术检测

    流式细胞仪细胞周期分析显示：CML、K562细胞组中G0/G1期细胞分别为： 35.4±3.9、33.7±4.2，与健康对照组G0/G1期细胞（52.3±5.2）相比减少；而S期细胞分别为62.4±5.2，64.3±5.8，与健康对照组S期细胞（40.0±2.6）相比增多，经统计学处理均有显著性差异(P<0.05)（图5、6、7，表4）。

     讨    论

    细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在G1期，它决定细胞能否通过G1期进入S期。调节细胞进入G1期的细胞周期蛋白主要是cyclin D和cyclin E。P27是细胞周期的负调控因子，作为重要的细胞周期抑制剂，主要抑制cyclin E?CDK2和cyclin D?CDK2等G1期激酶复合物，使细胞停滞在G1期。流式细胞仪细胞周期分析显示：与健康人骨髓单个核细胞相比，原代CML细胞和K562细胞G0/G1期细胞百分比降低，S期细胞百分比上升，这说明G1期缩短，细胞快速通过G1/S转换点进入S期，细胞增殖加速。

    宋俊敏等［2］构建了表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区单克隆抗体K562?ib?eGFP模型，并通过该模型研究了cyclin D2的表达与BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性之间的关系。结果表明：与转染了空载体或未转染的K562细胞相比，K562?ib?eGFP细胞的BCR/ABL及c?ABL蛋白的蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制；K562?ib?eGFP细胞中cyclin D2 mRNA以及蛋白质的表达水平均较K562细胞及K562?cGFP细胞明显降低。这一结果证实，CML中cyclin D2的表达上调与异常增高的BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性（PTK）具有直接的相关关系。Gersbert等［3］证实，强力霉素诱导的Ton B210细胞在转染P210 BCR/ABL前有高水平的P27表达，而转染后的细胞P27表达水平却很低，用BCR/ABL酪氨酸激酶的抑制剂STI571处理细胞后，P27水平上升。Jonuleit等［4］在转染了BCR/ABL的人和鼠细胞系中观察到，在表达BCR/ABL激酶活性后，P27水平快速下降，当使用STI571处理细胞后P27表达增加，而终止STI571 作用48小时后，P27水平又重新下降。这些都说明BCR/ABL介导的增殖信号改变中，调节P27水平是一个重要机制。P27表达下调与异常增高的BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性有直接的关系。

    CML细胞中具有异常酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白与白血病细胞恶性生长和增殖有密切关系，本研究用Western blot和RT?PCR方法检测K562细胞和原代CML细胞cyclin D2、cyclin E和p27的蛋白及mRNA表达水平。结果显示，cyclin D2和cyclin E 的表达水平明显升高，而p27表达明显降低，这说明BCR/ABL改变了上游信号转导途径，使cyclin D2、p27等细胞周期调控因子在CML中发生了明显改变，最终表现为细胞周期调控机制紊乱，加速细胞周期进程和细胞增殖。这与上述作者研究结论基本一致。

    细胞周期调控失常也与细胞内信号转导的紊乱、特别是受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，  RTK）信号转导途径（RTK?Ras?MAPK?CDKs）的紊乱有关。MAPK途径中的P38、ERK是决定细胞命运的关键分子，决定着细胞的分裂增殖、终末分化或进入凋亡程序。本研究结果显示：与健康人骨髓单个核细胞相比，K562细胞和原代CML细胞在cyclin D2、cyclin E、P27表达异常的同时，ERK、P38表达明显上升，且cyclin D2蛋白的表达与ERK、P38蛋白的表达呈正相关，与P27蛋白的表达呈负相关，这说明ERK、P38途径对CML细胞周期有调控作用。

    由此推测， CML的发病机制可能为CML细胞中具异常增高的酪氨酸激酶活性的BCR/ABL通过RTK?RAS?MAPK?CDKs通路使p38、ERK表达增高，从而激活其下游的cyclin D2、cyclin E、P27等细胞周期调控因子，致使细胞过度增殖，导致CML发生。

【】
  1张之南.血液病诊断及疗效标准.北京: 技术出版社. 1998: 219-221

2宋俊敏，徐冬，范尔进等. 慢性粒细胞性白血病 Cyclin D2基因表达的研究. 中华血液学杂志, 2004; 25：103-105

3Gersbert F, Sellers WR, Signoretti S, et al. BCR/ABL regulates expression of the cyclin? dependent kinase inhibitor p27Kip1 through the phostpharedy linositol 3?kinase/AKT pathway. J Biol Chem, 2000; 275:39223-39230

4Jonuleit T, van?der?Kuip H, Mething C, et al. Bcr?Abl kinase down?regulates cyclin?dependent kinase inhibitor p27 in human and murine cell lines. Blood, 2000; 96:1933-1939