人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究
【摘要】 本研究通过体外实验探讨人可溶性血管内皮生长因子受体1（sFLT?1）对白血病细胞增殖的抑制作用。用RT?PCR检测白血病细胞株K562、HL?60、U937和骨髓LTC?IC VEGF mRNA、VEGF?R1（FLT?1） mRNA的表达，用流式细胞术检测上述细胞VEGF和VEGF?R1(FLT?1)的表达，ELISA法检测细胞培养上清中VEGF的含量，将sFLT?1加入 K562、HL?60白血病细胞株和骨髓LTC?IC培养体系中，应用MTT法细胞生长的抑制率。结果显示：白血病细胞株K562、HL?60、U937和骨髓LTC?IC均表达VEGF，以K562表达VEGF量最高。K562和HL?60细胞株还表达FLT?1，U937细胞和骨髓LTC?IC表达的FLT?1表达量很低。sFLT?1明显抑制白血病细胞株K562及HL?60的生长，并且随着sFLT?1浓度的增加，其抑制率增加，以用药后48小时抑制作用最明显。结论： sFLT?1能够抑制某些白血病细胞株的生长，其抑制效应随用药浓度的增加而增加，而sFLT?1对正常骨髓细胞增殖无影响。
【关键词】 VEGF FLT?1 白血病细胞
Inhibition of Leukemic Cell Proliferation by Human Soluble VEGF?R1
Abstract The current study was purposed to investigate the inhibitory effect of human soluble vascular endothelial growth factor?1 (sFLT?1) on the proliferation of leukemic cells in vitro. Reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR) was used to detect the VEGF mRNA and VEGF?R1（FLT?1） mRNA in K562, HL60, U937 leukemic cell lines and bone marrow LTC?IC. Flow cytometry was used to detect the VEGF and VEGF?R1（FLT?1）in all above?mentioned cells. VEGF concentrations in the cell culture supernatants were determined by enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA). Cell proliferation was determined by MTT after adding sFLT?1 to K562， HL60 and LTC?IC culture system. The result showed that expression of VEGF could be detected in K562,HL60,U937 leukemic cell lines and LTC?IC, especially K562, K562 and HL60 cell lines also expressed FLT?1, but a little expression was found in U937 and LTC?IC. sFLT?1 could effectively inhibit the growth of K562 and HL60 cell lines in dose?dependent manner. The highest inhibition rate was found at 48 hours after adding sFLT?1. It is concluded that sFLT?1 can inhibit the growth of some leukemic cell lines, and the inhibition effect enhances as the concentration of the sFLT?1 increase, but sFLT ?1 not influence the proliferation of normal marrow cells.
Key word VEGF; FLT?1; leukemic cell
近年来越来越多的证据表明，血管内皮生长因子（VEGF）与白血病的发生、、演变及预后相关，它可以促进白血病细胞的生长、增殖和转移。因此以VEGF为靶点白血病已受到人们的广泛关注，目前许多研究集中于抗VEGF单克隆抗体，VEGF受体抑制剂［1,2］，反义寡核苷酸［3-5］等制剂的研究。然而，这些制剂均非内生性VEGF抑制剂， sFLT?1是内生的VEGF受体的拮抗剂，可特异性地与VEGF相结合，从而抑制VEGF的生物学活性［6,7］。 sFLT?1能抑制VEGF所引起的白血病细胞的增殖，但目前对于sFLT?1的研究尚处于探索阶段，本研究以表达VEGF及其受体的白血病细胞株为研究对象，观察sFLT?1对白血病细胞株及正常造血细胞的影响。
材料和方法
试剂
RPMI 1640培养液、IMDM为Gibco产品；胎牛血清、马血清、TRIZOL、DNA marker、琼脂糖、MTT均购自北京鼎国生物试剂公司；AMV逆转录酶为Promega产品，dNTPs、Oligo d(T)、Taq酶为TaKaRa产品；VEGF ELISA试剂盒、sFLT?1冻干粉购自北京晶美公司；VEGF单克隆抗体、VEGFR1单克隆抗体购自美国R＆D公司。
白血病细胞 CML急性变白血病细胞株K562、人早幼粒细胞白血病细胞系HL?60，人单核细胞白血病细胞株U937为吉林大学第一血液肿瘤科实验室保存株。3种细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、 5% CO2、饱和湿度条件下常规培养，3-4天传代1次。
骨髓长期培养起始细胞(LTC?IC) 取健康成年人抗凝骨髓5 ml，按常规分离骨髓单个核细胞，以含12。5%胎牛血清、12.5%马血清的IMDM 4 ml重悬细胞，建立Dexter培养体系，每周半量换液2次。
VEGF和FLT?1的检测
VEGF mRNA和FLT?1 mRNA的RT?PCR法检测 首先在NCBI?GenBank中查到VEGF mRNA及FLT?1 mRNA序列,根据确定目的基因的克隆范围,经计算机软件分析后设计引物。VEGF上游引物5′?ACCATGAACTTTCTGCTGTC?3′；下游引物5′?TCACCGCCTCGGCTTGTCAC?3′，扩增产物为651 bp；FLT?1上游引物5′?AGGGTACCCTCACCATGGTCAGCTACTG?3′；下游引物5′?CCCTCGAATTAGTGCCAGAACCACCTG?3′ ，扩增产物为1 407 bp。VEGF引物由北京鼎国公司合成，FLT?1引物由北京赛百盛公司合成。取生长状态良好的K562、U937、HL?60细胞株和骨髓LTC?IC各2×106细胞用TRIZOL一步法提取细胞总RNA，加适量DEPC水溶解，2%琼指糖电泳鉴定其纯度，并观察其是否降解，用DNA/RNA紫外分光光度计测定其含量。操作按AMV?RT逆转录酶说明书进行，取5 μl RNA溶于12 μl DEPC水中，加入Oligo?dT(18) 3 μl，70℃反应5分钟后置冰中冷却5分钟,再加入AMV 5×buffer 8 μl， 10 mmol/L的dNTPs 3 μl，RNasin 2 μl，AMV?RT 2 μl，DEPC水补足50 μl体积，42℃反应90分钟，95℃灭活，得cDNA，-20℃冻存备用。VEGF和Flt?1基因的PCR体系包括: Taq酶10×buffer 5 μl，10 mmol /L dNTPs 3 μl，VEGF或FLT?1基因上、下游引物各1 μl，Taq酶0.5 U, cDNA 5 μl，灭菌水补足50 μl体积。置PCR扩增仪上扩增。VEGF的PCR条件为94℃预变性5分钟,然后变性、退火、延伸分别为94℃变性60秒,55℃退火90秒,72℃延伸60秒,循环30次后,72℃延伸10分钟。FLT?1的PCR条件为: 94℃预变性5分钟,然后94℃变性60秒,56℃退火90秒,72℃延伸90秒,循环35次后,72℃延伸10分钟。所得PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,以β?actin作为内参照，共同用凝胶成像系统进行分析。
VEGF和FLT?1的流式细胞仪检测 分别取K562、U937、HL?60细胞和骨髓LTC?IC各5×105，按VEGF及FLT?1单克隆抗体说明书处理细胞，流式细胞仪检测各种细胞VEGF及FLT?1的表达。
细胞培养上清VEGF含量的ELISA法检测 分别以104/ml，105/ml，106/ml接种K562、U937、HL?60细胞和骨髓LTC?IC于6孔板中，培养体系成分同前，培养72小时后留取细胞培养上清按VEGF ELISA试剂盒说明书定量检测细胞培养上清中VEGF的含量。
sFlt?1对细胞生长的抑制作用
按5×105/（well·150 μl)接种K562、HL?60细胞和骨髓LTC?IC于96孔板，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养过夜，每3孔一组，加入不同浓度sFLT?1?1，浓度梯度分别为0.5 μg/150 μl、1.0 μg/150 μl、2.0 μg/150 μl、3.0 μg/150 μl，分别于24，48，72小时加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），继续培养4小时，终止培养，再加入150 μl DMSO，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪490 nm处测各孔OD值，同时设调零孔（培养液，MTT，DMSO），对照孔（不加sFLT?1细胞孔，培养液，MTT，DMSO）。根据OD值求出sFLT?1作用于K562、HL?60的抑瘤率。
抑瘤率=［（对照组OD值-实验组OD值）/
对照组OD值］×100
统计学处理
实验结果以数据和图表示，测定值以均数±标准差(±SD)表示，用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，采用直线相关分析，多因素方差分析，卡方检验，以双侧检验P≤0.05为存在统计学差异。
结 果
RT?PCR检测
对K562、U937、HL?60细胞和骨髓LTC?IC提取纯化的RNA用紫外分光光度仪检测,结果A260和A280的比值均在 1.9-2.1范围,证明无蛋白质污染。2%琼脂糖凝胶电泳呈现清晰的18S、28S(S为沉降系数)条带,28S条带含量约为18S条带的2倍（图1）,点样孔周围无明显EB染色出现,表明既无RNA降解也无DNA污染,纯度符合要求。
Figure 1. Electrophoresis pattern of total RNA of four type cells. Lane 1: LTC?IC. Lane 2: K562. Lane 3: U937. Lane 4: HL?60.
在K562、U937、HL?60细胞株和骨髓LTC?IC中检测到VEGF条带(651 bp)，说明以上4种细胞在分子水平上有VEGF的表达。在K562、U937、HL?60细胞株检测到 FLT?1条带（1 407 bp），说明这3种细胞在分子水平上有FLT?1表达，而LTC?IC在分子水平上则无FLT?1表达，所有片段与预计扩增产物的大小一致 ，如图2、3所示。
Figure 2. Expression of VEGF mRNA(651 bp). Lane 1: LTC?IC. Lane 3: U937. Lane 5: HL?60. Lane 7: K562. Lane 2,4,6,8:β?actin(318 bp). M: DL 2000 DNA marker.
Figure 3. Expression of FLT?1 mRNA (1407 bp). Lane 2: LTC?IC. Lane 4: U937. Lane 6: HL?60. Lane 8: K562. Lane 1，3，5，7:β?actin(318 bp). M: DL 2000 DNA marker.
流式细胞仪检测
图4表明，K562、U937、HL?60细胞和骨髓LTC?IC均表达VEGF，但表达率不同，白血病细胞株的表达率明显高于骨髓LTC?IC，应用SPSS 11.5统计学软件进行统计分析， P<0.01，存在统计学差异，其中K562细胞表达率最高，达35.55%，LTC?IC阳性表达率最低，为6.94%。
图5表明，K562细胞株Flt?1高表达， HL?60细胞株也有阳性表达，而U937细胞株和LTC?IC几乎不表达FLT?1，对阳性表达率做多个率卡方检验， P<0.01，故FLT?1流式细胞仪定量检测结果表明，4种细胞阳性表达率的差别有统计学意义,其中K562表达率最高,HL?60细胞株表达率虽较K562细胞株低,但较U937细胞株及LTC?IC仍明显升高。因U937细胞株几乎不表达FLT?1，自身分泌VEGF可能通过与其它受体结合或通过其它途径而发挥生物学效应，故在进行sFLT?1对白血病细胞生长抑制作用实验时未选用U937细胞株。
ELISA检测
表1为标准品的ELISA检测结果。应用SPSS 11.5统计软件对该组数据进行统计学分析,得出回归方程Y=183.13+1275.40X；对回归方程进行方差分析，在P<0.01水平上， VEGF浓度(Y)与OD值(X)之间有直线关系，对回归系数进行t检验，P<0.01,可认为回归系数有显著意义，以VEGF标准品浓度(Y)为纵轴，酶标仪测得OD值(X)为横轴绘制标准曲线如图6。
表2为不同细胞数培养上清VEGF浓度的检测结果，根据标准品的线性回归方程，得到各样本的浓度，并绘制成柱状图，见图7。
从表2及图7中数据可以看出，相同细胞浓度时LTC?IC细胞培养上清中VEGF的含量明显低于K562、HL?60、U937细胞株培养上清中VEGF的含量，且各种细胞培养上清中VEGF含量随着细胞浓度的增加而明显增高。对所得数据应用SPSS 11.5统计学软件进行多因素方差分析，结果表明在P<0.05水平上，K562、HL?60、U937细胞株培养上清中VEGF含量随着细胞浓度的增加而升高，1×104与1×105浓度时相比VEGF含量变化不大，与1×106浓度时相比差别显著（P<0.05）。而相同细胞浓度时，K562、HL?60、U937细胞株培养上清中VEGF的含量明显高于LTC?IC（P<0.05），有统计学差异。
Figure 7. Bargraph of concentration of VEGF in the supernatants of different concentration of cells.
MTT测定
sFLT?1对白血病细胞株增殖的影响 从图8、图9中可以看出， sFLT?1随着浓度的增加及作用时间的延长，对K562及HL?60细胞生长抑制作用明显增强，表现为其抑瘤率逐渐增高，而抑瘤率与时间的依赖性上则表现为相同浓度时48小时抑瘤率最高。分别对K562和HL?60细胞株的抑瘤率应用SPSS 11.5统计学软件进行统计分析，结果显示 sFLT?1对K562细胞株的生长抑制呈现时间、浓度双重性依赖关系，相同时间点各浓度的sFLT?1对K562细胞株的抑瘤率有显著的统计学差异（P<0.01）；相同浓度的sFLT?1作用于K562细胞株，则以48小时的抑瘤率最高，与24小时及72小时相比，有显著的统计学差异（P<0.01）。sFLT?1对HL?60细胞株的生长有抑制作用，而sFLT?1的浓度为主要相关因素，在同一时间点抑瘤率与sFLT?1浓度呈正相关关系，尤其当浓度超过1.0 μg/150 μl时对细胞生长抑制作用更为明显，有显著的统计学差异（P<0.01）；而从作用时间上分析，同一浓度不同时间点抑瘤率，在浓度为1.0 μg/150 μl和2.0 μg/150 μl时有显著性差异（P<0.05），而0.5 μg/150 μl和3.0 μg/150 μl浓度时各时间点抑瘤率差别无显著性（P>0.05）。由此可以看出，sFLT?1对HL?60细胞的抑制作用在时间与浓度上，浓度为其生长抑制作用的主要因素。K562细胞株与HL?60细胞相比，作用24小时时各浓度组抑瘤率之间比较，差别无统计学差别（P>0.05），作用48小时和72小时，两种细胞各浓度水平上的抑瘤率差别均有显著差别（P<0。05），故从作用时间和作用浓度两方面比较sFLT?1对K562和HL?60细胞生长抑制作用得出：sFLT?1作用时间超过24小时后，各浓度组对细胞生长抑制作用要明显强于相同时间点对HL?60细胞的抑制程度，其中作用48小时时差别最显著。
sFLT?1对骨髓LTC?IC增殖的影响
图10表明，不同浓度的sFLT?1作用于LTC?IC时，从作用时间及作用浓度两方面来看，对LTC?IC的生长增殖几乎没有影响，MTT检测所得的OD值变化不明显，各浓度各时间点OD值与对照组（即sFLT?1浓度为0）相比无统计学差异（P>0.05）。
sFLT?1作用于K562及HL?60细胞后从时间及浓度双重因素分析，48小时这一时间点各浓度抑瘤率均达最高值，以48小时为时间点，绘制sFLT?1作用于K562、HL?60和LTC?IC抑瘤率折线图，得到图11。从图11可以看出，sFLT?1对LTC?IC的抑制曲线几乎为零线，对K562和HL?60细胞的抑制程度随浓度的增加而增强，而对K562细胞的抑制率明显强于对HL?60的抑制率，有明显统计学差异(P<0.05)。
讨 论
抑制血管新生实体瘤的良好疗效，激励人们探索白血病的抗血管新生疗法。研究表明，白血病细胞能够分泌VEGF，同时其细胞表面还存在VEGF受体（VEGFR）［6］，因此，VEGF促进白血病细胞增殖通过两个途径：一是VEGF与白血病细胞表面的VEGF受体结合，通过自分泌途径刺激白血病细胞增殖；一是与骨髓中内皮细胞上VEGF受体结合，通过旁分泌途径刺激白血病细胞增殖。如果能够在骨髓中阻断VEGF与细胞表面受体的结合，就能阻断VEGF刺激白血病细胞增殖的细胞传导通路，而达到治疗白血病的目的。sFLT?1是FLT?1的胞外部分，其产生机制之一是FLT?1转录产物经不同的剪接形成的，另一机制可能是由于跨膜受体在蛋白水解酶的作用下将胞外部分水解脱落形成［7］。体外实验表明，sFLT?1能够与VEGF结合，中和血浆中VEGF，减少其与膜表面受体的结合，同时，sFLT?1还能够与与膜受体结合形成异源二聚体，阻断VEGF介导的受体酪氨酸磷酸化及激活下游的信号转导途径而抑制VEGF的激活。因此，sFLT?1可以作为VEGF受体拮抗剂，阻断VEGF诱导的细胞增殖和迁移［8］。本实验选择sFLT?1是因为它是体内天然存在的成分，只是含量很少，如果能够在体外证实其具有抑制白血病细胞增殖的作用，则可能将其作为目的基因转染骨髓基质细胞，使其在骨髓局部分泌高浓度sFLT?1，为白血病的治疗开辟一种新途径。
基于上述设想，首先我们对实验细胞是否表达VEGF及其受体，采用RT?PCR、流式细胞术、ELISA 3种方法同时进行检测，虽然目前已有许多关于白血病细胞系表达VEGF及受体的报道，但多数只是限于上述一种方法学检测，实验差异很大。本实验使用3种方法同时进行，从不同的角度了解白血病细胞及正常细胞表达VEGF及受体情况，其结果具有可信性，也保证了实验结果的可靠性。3种检测方法中流式细胞术检测能进行半定量分析，对实验结果的评价具有一定的指导意义。检测结果表明，K562、HL?60、U937细胞均有VEGF高表达，K562、HL?60细胞同时表达FLT?1，但表达量有差异。从流式细胞术检测结果可以看出，K562细胞无论是VEGF还是FLT?1，表达量都是最高的，而U937细胞VEGF及FLT?1表达均最低，这表明不同类型的白血病及不同的病人可能对抗VEGF治疗存在异质性，需在研究中加以注意。另外，为了证明上述细胞是否具有自分泌VEGF的功能，我们将上述细胞进行培养，观察培养上清中VEGF含量，应用ELISA方法定行定量检测。从细胞培养上清中的VEGF含量的检测结果可以看出，随着细胞浓度的增加，分泌到细胞培养上清中的VEGF量也随之增高，这提示我们血浆中VEGF含量可间接反应出体内白血病细胞负荷量，有助于选择治疗方案及判断预后。最后，我们在K562、HL?60细胞及LTC?IC培养体系中加入不同浓度sFLT?1，观察细胞生长状态。结果表明sFLT?1能明显的抑制K562和HL?60白血病细胞的增殖，而且随着sFLT?1浓度的增加及作用时间的延长，其抑制率增加，说明sFLT?1具有抑制某些白血病细胞系增殖的作用。而骨髓起始细胞（LTC?IC）中加入sFLT?1后，LTC?IC的生长几乎没受影响，表明抑制VEGF活性不会影响正常骨髓细胞的增殖。这就提示我们，sFLT?1可能通过抑制VEGF的活性抑制白血病细胞增殖，将sFLT?1基因转染至骨髓间充质干细胞再回输白血病患者体内，在骨髓微环境中稳定表达sFLT?1蛋白从而达到治疗白血病的目的，这对进一步开发sFLT?1的基因疗法很有意义。从作用机理上探讨，如果骨髓环境中有高浓度的sFLT?1，则其中和VEGF的作用会更直接、更有效，因此，sFLT?1的基因治疗具有潜在的应用前景。白血病的生物靶点治疗，弥补白血病化疗的弊端，将为治疗白血病提供新策略。
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