人巨细胞病毒体外感染诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡
【摘要】 本研究探讨人巨细胞病毒(hCMV)体外感染是否可引起早幼粒细胞的增殖、分化抑制、诱导其凋亡，并探讨其作用机制。 采用hCMV AD169 株体外感染早幼粒细胞白血病细胞HL?60，用PCR 检测hCMV DNA，用形态学观察、DNA 片段化检测及Annexin Ⅴ/PI 染色流式细胞仪检测等方法分析细胞凋亡情况。结果表明： hCMV AD169 株在体外能明显抑制早幼粒细胞白血病细胞HL?60的生长，抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系；PCR 检测发现病毒感染组HL?60 细胞中有hCMV IEA 的表达；形态学观察和DNA 片段化检测证实了细胞凋亡的存在；流式细胞仪检测结果显示HL?60 细胞凋亡率随培养液中病毒浓度的加大和感染时间的延长而增高，二者呈依赖关系。结论： hCMV AD169株在体外可直接感染HL?60 细胞；hCMV AD169 株在体外感染HL?60 细胞后，可抑制HL?60 细胞的分化和增殖；hCMV AD169 株体外感染HL?60 细胞后可诱导其凋亡，且凋亡率与病毒剂量及作用时间呈依赖性关系。
【关键词】 人巨细胞病毒 早幼粒细胞白血病细胞 细胞凋亡 病毒感染
Human Cytomegalovirus Induces Apoptosis of Human Promyelocytic Leukemic Cells via Direct Infection In Vitro
Abstract The study was purposed to investigate the proliferation and the suppression effect of human cytomegalovirus (hCMV) on human promyelocyte cell line HL?60, and to study whether hCMV can induce apoptosis of HL?60 via direct infection in vitro and its mechanism. Promyelocyte cell line HL?60 and hCMV AD169 strain were co?cultured. PCR was used to detect the direct infection of HL?60 cells by hCMV IEA expression. The apoptosis cells were analyzed by morphologic observation, DNA ladder formation, flow cytometry with Annexin Ⅴ/PI stain. The results indicated that hCMV AD169 suppressed the differentiation and proliferation of HL?60 cells in vitro significantly (P<0.05). The suppression was dose?dependent. hCMV DNA was successfully detected in HL?60 cells of viral infection groups by PCR. The apoptotic cells were confirmed by morphologic observation and DNA ladder formation. The results of flow cytometry showed that the percentage of apoptotic cells increased along with the increase of hCMV titer and the time after infection. It is concluded that the promyelocyte can be infected directly by hCMV AD169 strain. hCMV AD169 strain inhibited the differentiation and proliferation of promyelocyte. The apoptosis of HL?60 cells can be induced by hCMV infection. With the increase of viral infectious titer and the time after infection，the percentage of apoptotic cells also increase and produce in dose?dependent and time? dependent manner. Induced apoptosis may be one of the mechanisms of granulocytopenia induced by hCMV infection.
Key words human cytomegalovirus; promyelocytic leukemic cell; apoptosis; virus infection
人巨细胞病毒（hCMV）是一种在人群中广泛存在的病毒，儿童是其原发感染的最主要的人群，受感染者的造血、血液系统是主要受累部位之一［1］。对hCMV感染的研究，特别是对于器官移植后hCMV感染的研究，一直是国际上医学界关注的热点。如今，hCMV感染已被认为是骨髓移植和白血病化疗失败的主要原因之一［2］。国内外学者对hCMV和造血细胞作用的研究多集中于CFU?GM、CFU?E、CFU?Mix及CFU?MK方面，实验证实hCMV对各系造血祖细胞的分化和增殖均有抑制作用［2，3］。hCMV是否能诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡的问题尚无定论，国内尚未有类似研究报道。本实验采 用hCMV体外感染早幼粒细胞白血病细胞系HL?60，研究hCMV对早幼粒细胞白血病细胞的影响，并初步探讨其作用机制。
病毒
hCMV AD169株取自华中科技大学附属同济儿科病毒实验室，效价为2×107 pfu/ml，应用前部分病毒原液用单倍RPMI 1640培养液稀释10倍、100倍、1000倍，依次获取效价为 10-1 hCMV原液组，10-2 hCMV原液组，10-3 hCMV原液组的病毒液。
细胞株
早幼粒细胞白血病HL?60细胞株由香港中文大学儿科系实验室馈赠，用含10% FBS的RPMI 1640培养液于37℃、5% CO2条件下常规培养，每周换液3次，传代1次。取对数增殖期细胞用于实验。
主要试剂
RPMI 1640培养液粉剂是美国Invitrogen公司产品（批号1165062）。hCMV检测试剂盒购于华美生物工程公司。DNA抽提试剂盒（K201型）购于上海申能博彩生物科技有限公司。Annexin V/PI双标试剂盒购于Becton Dickinson Biosciences公司。
感染与分组
病毒感染采用持续性感染方式，即将hCMV直接加入培养体系中混合培养。实验共分4组，即对照组(含10%FBS的RPMI 1640培养液，不加病毒)、10-1hCMV组（10-1组）、10-2hCMV组（10-2组）、10-3hCMV组（10-3组）。
hCMV的PCR检测
分别于3、5、7天收集各实验组细胞，用PBS洗1-2次，进行hCMV DNA抽提，按抽提试剂盒步骤操作，之后进行PCR扩增，用含1 μg/ml EB的2%的琼脂糖凝胶电泳后鉴定hCMV DNA。
hCMV感染HL?60细胞存活率监测
分别于培养后3、5、7天收集各实验组部分细胞，取一滴于玻片上，台盼蓝染色后在细胞计数板上计数存活率。
hCMV AD169株感染HL?60细胞凋亡的检测
形态学观察 分别在感染之后3、5、7天收集细胞，Giemsa染色后，在光学显微镜下观察细胞的形态并摄影。
DNA断裂检测 分别在感染后3、5、7天收集细胞，抽提DNA。抽提到的DNA在含1 μg/ml EB的2% 的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统在紫外灯下观察DNA梯样条带，并摄影。
Annexin V/PI双染流式细胞仪检测 分别在感染后3、5、7天收集各实验组细胞，每次至少收集106个细胞，依Annexin V/PI双标试剂盒操作步骤处理细胞，用Annexin V及PI双染后，即刻用流式细胞仪检测凋亡细胞，流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI，记录凋亡率。
PI染色流式细胞仪分析 分别在感染后3、5、7天收集并处理各实验组细胞，每次至少收集106个细胞，PI染色后，即刻用流式细胞仪检测，低于G1期DNA含量的亚二倍体细胞群为凋亡细胞，记录凋亡率。
统计学处理
所有资料用均数±标准差（±SD）记录，各组间采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。对照组与各实验组进行比较，各实验组在不同的时间段进行比较。
结 果
PCR扩增各实验组中hCMV DNA
收集各实验组细胞，抽提DNA并进行PCR扩增，在2%的琼脂糖凝胶中电泳后，紫外灯下观察， 各实验组均可见一条特异性扩增条带，约599 bp，而对照组未见阳性条带，提示病毒直接感染细胞，细胞中存在hCMV DNA（图1）。
Figure 1. Expression of hCMV IEA in HL?60 cells infected with hCMV. M： marker. Lane 1，2，3： 10-1，10-2，10-3 groups. C：control group.
各实验组不同时间的细胞存活率
在感染后3、5、7天，收集各组的部分细胞，进行台盼蓝染色，监测细胞存活力。结果显示：随着病毒浓度的加大，感染后时间的延长，各实验组的细胞存活率下降，对照组不受影响（图2）。
Figure 2. Effect of hCMV AD 169 on the survival rate of HL?60 cells at different days.
Giemsa染色细胞形态学观察
hCMV感染细胞后，经Giemsa染色至感染后第5天，光学显微镜下观察显示，实验组中有些细胞透亮度减低，细胞膜皱缩、核碎裂，提示有凋亡改变。各实验组凋亡细胞数量略有不同，对照组未见明显凋亡细胞（图3） 。
Figure 3. Effect of hCMV AD 169 on the morphology of HL?60 cells with Giemsa stainning. A,B: morphology of infected cells. C: morphology of control cells.
DNA断裂检测
分别于感染后3、5、7天收集各实验组细胞，粗提DNA，琼脂糖凝胶电泳观察，在感染后第5天、7天，可见典型的DNA梯形条带，随着感染剂量的加大， 条带逐渐明显（图4）。
Figure 4. DNA fragmentations in hCMV?infected HL?60 cells. M: marker. C: control group. Lane 1 ,2 ,3: 10-1，10-2，10-3 groups.
Annexin V/PI双染流式细胞仪检测
分别于感染后3，5，7天收集各实验组细胞，经处理后进行凋亡检测，记录凋亡率。结果发现，各实验组的凋亡率明显高于对照组，且随着剂量的加大、时间的延长，凋亡率逐渐增加（表1）。
Table 1. Apoptosis rate of HL?60 cells infected with hCMV (Anxiexin V/ PI) (n＝10, ±SD)
GroupApoptosis rate(%)3 days5 days7 daysControl1.80±0.372.36±0.733.35±1.0510-3hCMV4.30±1.85*△#10.70±1.57*△#16.40±1.39*△#10-2hCMV14.80±1.72*△#19.70±2.74*△#26.40±1.68*△#10-1hCMV22.10±2.06*△#28.80±3.16*△#35.20±2.71*△#*Comparison between the hCMV infected groups and the control at the same incubation days (P<0.05). △Comparison between experimental groups of different virus doses at the same incubation days (P<0.05). #Comparison between different groups in different incubation days with hCMV infection (P<0.05).
PI染色流式细胞仪分析
分别于感染后3、5、7天收集各实验组细胞，经处理后进行凋亡检测，可见位于G1期前的亚二倍体峰，即为凋亡细胞群，记录凋亡率。观察发现，各实验组的凋亡率明显高于对照组，且随着剂量的加大，时间的延长，凋亡率逐渐增加（表2）。
讨 论
许多实验已证实，hCMV感染对造血祖细胞各系的分化、增殖均有抑制作用，并可诱导其凋亡［2，3］。hCMV感染细胞过程中首先附着于细胞表面，在合适的离子和PH条件下，借其包膜蛋白（gB和gH）与细胞表面受体（低结合力的肝素受体和高结合力的蛋白受体）结合后，通过受体介导的机制进入细胞内。也可通过其他途径如直接穿过胞浆膜进入细胞内。病毒进入细胞内，病毒DNA被转运至细胞核内，在细胞内增殖，复制其核酸和蛋白质，产生子代，同时造成组织病变［5］。通过检测宿主细胞内的病毒核酸和转录产物可反映病毒对宿主细胞的直接感染，目前实验中通常使用PCR检测细胞的hCMV DNA 和用RT?PCR检测hCMV自我复制的即刻－早期（immediate?early， IE）mRNA的两种方法，以判断病毒是否侵入宿主细胞。本实验采取具有速度快，特异性强，灵敏度高的PCR检测感染后HL?60细胞内的hCMV DNA。实验过程中，按照步骤用hCMV?DNA试剂盒抽提感染组和对照组细胞的核酸提取物，PCR技术特异性扩增后，经电泳显示特异性条带，各感染组特异性条带均阳性，DNA片段长度约599bp，与理论上设计的引物［6］ (P1: 5' ATGGAGTCCTCTGCCAAGAGA 3'; P2: 5' CAGCATGTGCTCCTTGAT 3')应扩增的产物基本一致，对照组中未见特异性条带，表明hCMV AD169株可直接感染HL?60细胞。
我们的实验结果显示:病毒感染组HL?60细胞的集落形成均出现不同程度的减少，表明hCMV AD169株实验株对HL?60细胞的分化、增殖具有抑制作用。hCMV体外感染的HL?60细胞受到了病毒损伤，其抑制程度与病毒感染浓度及时间有关，随着感染时间延长，病毒浓度加大，细胞受损程度在增大，呈剂量依赖性，抑制程度与病毒感染浓度呈正相关。国外有研究小组曾观察到hCMV感染对HL?60细胞的凋亡无明显诱导作用。Moon等［7］报告hCMV Towne株体外感染HL?60细胞，病毒对HL－60细胞的凋亡影响不明显。本实验结果表明hCMV AD169株可明显引起HL?60细胞发生凋亡。这可能与所用的病毒株类以及病毒浓度不同有关。曾有研究者发现hCMV毒株的不同导致感染后造血祖细胞hCMV DNA的表达不同［8］。
hCMV感染所引起的损伤中，宿主细胞凋亡较为常见［9］。有研究表明，hCMV感染诱导的造血祖细胞生长抑制与细胞凋亡有关系。Sindre等［10］用hCMV感染造血祖细胞，发现细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达减少，特异性的DNA凋亡片段数目增加，表明hCMV感染同样可以诱导造血祖细胞凋亡。本实验用目前比较成熟的定性法和定量法从这三个方面对hCMV体外感染HL?60细胞株诱导凋亡进行定性定量的检测。结果表明：hCMV AD169株体外感染能诱导HL?60细胞凋亡，并随时间延长、病毒浓度的加大而上升。本实验中hCMV AD169株体外感染诱导HL?60细胞凋亡，但其凋亡由哪种凋亡蛋白所介导，其作用位点在哪里，这些蛋白在其中起什么作用，以及如何阻断其凋亡，尚需今后的研究工作进一步深入探讨。
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1邵济钧. 巨细胞病毒. 见：闻玉梅主编. 医学微生物学.上海：上海医科大学出版社. 1999：925-937
2Reusser P, Einsele H, Lee J, et al. Randomized multicenter trial of foscarnet versus ganciclovir for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Blood, 2002; 99:1159-1164
3何政贤，潘思年，陈健良等. 人巨细胞病毒对造血系统的影响. 中华儿科杂志, 2003, 41： 321-324
4Demmler GJ. Cytomegalovirus. In: Feigin RD, Cherry JD. Textbook of Pediatric Infectious Diseases. 4th ed. Philadelphia： W. B. Saunders Co. 1998: 1732-1746
5 怀特D.O, 芬纳F.J著（郑志明等译）. 医用病毒学. 北京, 出版社, 1990: 71-97
6熊伟, 何政贤, 王清文等. 巨细胞病毒对人骨髓粒?巨噬系祖细胞生长的影响. 中华血液学杂志,1999; 20: 143-145
7Moon MS, Lee GC, Kim JH, et al. Human cytomegalovirus induces apoptosis in promonocyte THP?1 cells but not in promyeloid HL?60 cells. Virus Res, 2003; 94:67-77
8Minton EJ, Tysoe C, Sinclair JH, et al. Human cytomegalovirus infection of the monocyte/macrophage lineage in bone marrow. J Virol, 1994; 68:4017-4021
9胡野，凌志强，单小云. 细胞凋亡的分子医学. 北京： 军事医学科学出版社. 2002：335-337
10Sindre H, Rollag H, Olafsen MK, et al. Human cytomegalovirus induces apoptosis in the hematopoietic cell line MO7e. APMIS, 2000; 108:223-23011Trincado DE, Scott GM, White PA, et al. Human cytomegalovirus strains associated with congenital and perinatal infections. J Med Virol, 2000 Aug; 61(4):481?7［］?μβαγ ±SD+
