三七总皂甙诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞
【摘要】 为了研究三七总皂甙(total panax notoginseng saponins, tPNS)对脐血单个核细胞诱导出内皮细胞的影响,采用含三七总皂甙的DMEM对脐血单个核细胞进行诱导，用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞表面标记UEA?1、功能标志vWF及CD31的变化。结果显示： 250 mg/L tPNS组诱导所得的贴壁细胞数及结合UEA?1的阳性率均多于其它浓度的三七总皂甙组（P<0.05）。50 ng/ml VEGF+250 mg/L tPNS组表达CD31和结合UEA?1阳性的贴壁细胞数与50 ng/ml VEGF组相比较，无明显的差异(P>0.05)。结论：中药三七总皂甙可以诱导脐血部分单个核细胞分化为内皮细胞；合用三七总皂甙和VEGF无协同诱导作用。
【关键词】 三七总皂甙 脐血 单个核细胞 内皮细胞
Effect of Total Panax Notoginseng Saponins on Inducing Differen?tiation of Mononuclear Cells in Human Cord Blood into Endothelial Cells
Abstract To investigate the effect of total panax notoginseng saponins （tPNS） to induce the differentiation of mononuclear cells (MNC) in cord blood into endothelial cells， the DMEM culture media containing tPNS were used to induce the MNC of cord blood. Then, the morphology of the adherent cells was observed by the light microscopy and the fluorescence microscopy, the changes of cell surface markers (UEA?1), function marker (vWF) and CD31 were detected by flow cytometry. The results showed that the number of adherent cells produced by 250 mg/L tPNS and the positive rate of cells expressing CD31 and UEA?1 were higher than those in the groups of other concentrations（P<0.05）. There was no significant difference in the number of adherent cells expressing CD31 and UEA?1 between 50 ng/ml VEGF+250 mg/L tPNS and 50 ng/ml VEGF. It is concluded that the traditional Chinese drug tPNS can induce partial MNC in the cord blood to differentiate into endothelial cells. No synergistic effect has been found between tPNS and VEGF.
Key words total panax notoginseng saponins; cord blood; mononuclear cell; endothelial cell
三七总皂甙（total panax notoginseng saponins, tPNS）是我国中药田三七的主要药用成分，主要含人参二醇型皂甙Rb1、人参三醇型皂甙Rg1和生物碱等成分，能特异性地阻断受体操纵性的钙离子通道，具有扩张血管、降低心脏后负荷、减少心肌耗氧量和心律失常的作用，常用于中风、脑缺血等疾病［1］，还可使心肌缺血区面积明显缩小［2］。微循环的改善与内皮细胞的形成和功能密切相关，内皮细胞的生成是血管新生的基础，在机体病理生理过程中具有重要作用。本实验通过使用tPNS诱导脐血部分单个核细胞分化为内皮细胞，探讨tPNS对内皮细胞形成的作用。
材料和方法
材料和试剂
脐血来源于本院妇产科健康足月妊娠产妇（顺产）脐带血，肝素抗凝。tPNS购自北京生物制品检定所，内皮细胞黏附因子购自Cascade Biologics公司，FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素（Ulex europaeus agglutinin?1， UEA?1）购自Sigma公司，FITC标记的抗人CD31单克隆抗体购自eBioscience公司， FITC标记的抗人vWF单克隆抗体购自Becton Dickinson Biosciences公司，淋巴细胞分离液购自H&Y Bio 公司，DMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自北京元亨圣马生物研究所， Epics XL型流式细胞仪为美国Coulter公司产品。
用Ficoll淋巴细胞分离液（比重1.077）分离脐血单个核细胞并培养于含有10%胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM中，调整细胞数至1×106/ml置入培养瓶中，在含37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时。
培养24小时前、后单个核细胞UEA?1和CD31阳性率的测定
取分离出的脐血单个核细胞悬液(1×106/ml)100 μl，分别加入UEA?1?FITC、CD31?FITC 各20 μl，室温避光孵育30分钟，再用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次，加1 ml PBS重悬细胞，立即在流式细胞仪上检测UEA?1和CD31阳性率。取培养24小时后未贴壁的细胞悬液，按上述方法制备，检测UEA?1和CD31阳性率，同培养前进行比较。
不同浓度tPNS诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞的检测
在24孔培养板各孔中加入0.1%内皮细胞黏附因子0.5 ml，37℃静置30分钟，待培养板底部形成明胶膜后吸弃上清液。将培养24小时后未贴壁的脐血单个核细胞进行细胞计数，调整细胞浓度至（1-2）×106/ml，每孔加入0.5 ml细胞悬液，接种于培养板中，然后分别加入终浓度为0、125、250、500、1 000、2 000 mg/L的含tPNS的DMEM，每个浓度取4个平行孔，重复5次。培养72小时后，各组均换成不含tPNS的DMEM，每48小时半量换液，培养至第7天，倒置显微镜下观察每孔细胞的形态。弃去培养液，用 PBS液洗3次，再用0.25%胰蛋白酶消化后洗下贴壁细胞进行细胞计数。
贴壁细胞结合UEA?1阳性率的流式细胞术检测
培养至第7天吸弃悬浮细胞，将各组培养所得贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心，洗涤，用流式细胞仪检测并比较各组贴壁细胞结合UEA?1的阳性率。
贴壁细胞的表面标记及形态鉴定
以tPNS终浓度为250 mg/L的DMEM诱导脐血单个核细胞，培养至第7天将部分贴壁细胞洗下行流式细胞仪检测（结合UEA?1阳性率，表达CD31阳性率，表达vWF阳性率）。部分细胞培养至第14天，倒置显微镜下观察并拍照，吸弃培养液，用PBS液洗涤后加入UEA?1?FITC，置于荧光显微镜下观察并拍照，发绿色荧光的细胞为阳性细胞。
tPNS、VEGF及两者联合体外诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞的检测
将脐血单个核细胞中未贴壁细胞进行细胞计数，调整细胞浓度至（1-2）×106/ml，每孔加入0.5 ml细胞悬液，接种于含明胶膜的24孔培养板中，然后分别加入终浓度为250 mg/L tPNS、50 ng/ml VEGF、250 mg/L tPNS+50 ng/ml VEGF和空白DMEM。培养72小时，各组均换成DMEM，培养至第7天，行贴壁细胞计数，并用流式细胞仪检测结合UEA?1和表达CD31的阳性率。用贴壁细胞数乘以结合UEA?1阳性率和表达CD31阳性率即为所得阳性贴壁细胞数。重复5次，进行组间比较。
统计学分析
数据应用均数±标准差（±SD）表示，各实验组均数间多重比较采用LSD?t检验（方差齐）或Dunnett T3检验（方差不齐时）。P<0.05为差异有显著性。
结 果
培养前后脐血单个核细胞结合UEA?1和表达CD31阳性率变化
分离后即刻检测脐血单个核细胞结合UEA?1阳性率为45.1%，表达CD31阳性率为24.0%。培养24小时未贴壁细胞结合UEA?1阳性率为4.4%，表达CD31阳性率为12.0%。
培养过程中细胞形态观察
在培养7天过程中，除1 000 mg/L组和2 000 mg/L组外，各孔细胞在第3天后均可见部分贴壁细胞体积增大，形态由圆形变为梭形，平铺于培养板底，在各孔中央均有细胞团形成。250 mg/L tPNS组贴壁细胞数明显多于其它组，而1 000 mg/L组和2 000 mg/L组镜下可见破裂细胞（图1-图6）。
250 mg/L tPNS组培养14天所得贴壁细胞光学显微镜下形态变化见图7。
用含250 mg/L tPNS DMEM诱导72小时后,改用DMEM培养至第14天,得到的贴壁细胞结合UEA?1?FITC的荧光照片见图8。
贴壁细胞数、形态及结合UEA?1阳性率变化
250 mg/L tPNS组对脐血单核个细胞的诱导作用最强，125 mg/L组和500 mg/L组次之，高浓度tPNS不仅不能诱导脐血单个核细胞分化，而且还会导致其死亡（表1）。
250 mg/L tPNS组培养第7和14天所得贴壁细胞表面标记变化
第7天时贴壁细胞UEA?1阳性率为46.6%，CD31阳性率37.6%，vWF阳性率为2.3%。第14天时贴壁细胞UEA?1C阳性率为45.2%，CD31阳性率为25.1%,vWF阳性率为24.0%（图9）。
同诱导物所得阳性贴壁细胞数比较
250 mg/L tPNS组、50 ng/ml VEGF组以及50 ng/ml VEGF+250 mg/L tPNS组培养7天后得到的结合UEA?1和表达CD31阳性贴壁细胞数均明显多于对照组。50 ng/ml VEGF组培养7天所得的结合UEA?1和表达CD31阳性贴壁细胞数明显多于250 mg/L tPNS组（P<0.01），而50 ng/ml VEGF+250 mg/L tPNS组与50 ng/ml VEGF组相比较无差异（P>0.05）（表2）。
讨 论
微血管内皮细胞的特征标志众多，例如： vWF、乙酰化低密度脂蛋白、血管紧张素转换酶、UEA?1、CD31、Flt?1、Flk?1等［3］。本实验选择UEA?1、vWF和CD31，前两者均为内皮细胞系较为特异的标志物，而CD31尽管并非内皮细胞特异性标志物，但可以将内皮细胞与贴壁的成纤维细胞区别开。确认微血管内皮细胞的最好办法是测定细胞的一系列特征后作出综合评定［3］。本试验通过细胞形态学观察（光镜下和荧光显微镜下）及系列细胞表面标记（UEA?1和CD31）和功能标志（vWF）的变化研究了tPNS诱导脐血单个核细胞转化为内皮前体细胞，进而再转化为成熟内皮细胞的过程。
已有报道，从脐血单个核细胞中可诱导出内皮细胞［4-6］，因此本实验采用的是脐血单个核细胞。由于在脐血采集过程中可能有来自脐静脉壁上的内皮细胞混入脐血或脐血中已经存在成熟的内皮细胞，为此我们将得到的脐血单个核细胞在培养瓶中培养24小时以去除这些成熟内皮细胞。有实验证明，从脐血中提取的CD133+干/祖细胞在48小时内不会贴壁，贴壁法可以去除单核巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞［7］。
脐血单个核细胞包含许多细胞成分，既有造血的成体干细胞也有非造血的成体干细胞。据文献报道，有人从造血干细胞中诱导出内皮细胞［8］，也有人从间充质干细胞中诱导出内皮细胞［9］。本实验培养板中贴壁的单个核细胞主要含有间充质干细胞，故推测内皮细胞可能由间充质干细胞诱导分化而成。
有文献报道，不同浓度的tPNS可促进猪主动脉内皮细胞（PAEC）产生NO，其中当tPNS浓度为250 mg/L时，PAEC分泌NO的含量便急剧上升，然后随着tPNS浓度的增加，培养液中NO的含量，稍有上升，基本维持在一个平台上［10］。NO途径对于造血干细胞来源的内皮祖细胞活性有重要作用［11］。因此我们认为，tPNS诱导脐血单个核细胞转化为内皮细胞可能与NO有关。目前对于中药tPNS的药理作用我们了解得还远远不够，对于tPNS体内作用效果仍有待进一步研究。
【文献】
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10尹小川，刘建康，周序珑等. 三七总皂甙对培养的猪主动脉内皮细胞释放一氧化氮的影响. 中国动脉硬化杂志, 1996; 4：20-23
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