蟾蜍灵在诱导HL?60细胞凋亡过程中对Bcl?2和PKC的影响
【摘要】 为了研究蟾蜍灵在诱导HL?60细胞凋亡过程中对Bcl?2表达与裂解和磷酸化的作用，及对蛋白激酶C（PKC）活性与PKCs亚细胞定位的影响，分别采用台盼蓝拒染法检测细胞生存率，细胞染色法观察凋亡形态，流式细胞术分析细胞周期，琼脂糖凝胶电泳检测凋亡DNA片段化，［γ?32P ］同位素掺入法测定PKC活性，Western blot分析Bcl?2及PKC蛋白表达。结果表明：①蟾蜍灵抑制HL?60细胞增殖，24、48及72小时的IC50分别为(25.8±2.1)、(8.0±1.2)及 (2.3±0.3) nmol/L; ②50 nmol/L蟾蜍灵作用24小时可诱导HL?60细胞凋亡; ③50 nmol/L 蟾蜍灵处理HL?60细胞6-24小时，Bcl?2蛋白表达水平明显下调，并出现23 kD的裂解片段，磷酸化水平逐渐降低; ④1-100 nmol/L 蟾蜍灵分别作用30分钟，对PKC总活性无影响，但可促使PKCβⅡ膜转位。结论：蟾蜍灵诱导HL?60细胞凋亡可能与Bcl?2表达降低、裂解及脱磷酸化有关。
【关键词】 白血病 蟾蜍灵 凋亡 Bcl?2 蛋白激酶C
Effect of Bufalin?Inducing Apoptosis on Bcl?2 and PKC in HL?60 Cells
Abstract Previous study revealed that bufalin can inhibit proliferation, and induce apoptosis in some human cancer cell lines. However, the mechanism of its anticancer effect has not been fully understood. The present study was designed to investigate the effects of bufalin?induced apoptosis on Bcl?2 and PKC in human leukemic HL?60 cells. The cell viability was determined by trypan blue dye exclusion. The apoptosis was detected by morphology, flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis. The expressions of Bcl?2 and PKC were analyzed by Western blot, and activity of PKC was assayed by ［γ?32P］ isotope incorporation method.The results showed as follows: (1) proliferation of HL?60 cells was inhibited by bufalin and the IC50 at 24, 48, 72 hours were (25.8±2.1), (8.0±1.2) and (2.3±0.3) nmol/L, respectively. (2) apoptosis of HL?60 cells was induced when the cells were treated with bufalin at concentration of 50 nmol/L for 24 hours. (3) compared with control, treatment with bufalin at concentration of 50 nmol/L for 6-24 hours resulted in downregulation of protein expression, decrease of phosphorylation, and cleavage of Bcl?2, simultaneously. (4) the activity of total PKC was unchanged when HL?60 cells were exposed to 1-100 nmol/L bufalin for 30 minutes, but PKCβⅡ underwent translocation from cytosol to membrane. It is concluded that apoptosis induced by bufalin is associated with downregulation of protein expression, dephosphorylation, and cleavage of Bcl?2 in HL?60 cells.
Key words leukemia; bufalin; apoptosis; Bcl?2; PKC
中药蟾酥在我国已广泛应用于恶性肿瘤的，但其成分复杂，作用机理不明。蟾蜍灵是蟾酥的主要配基之一，近年来国外和我们的研究表明，蟾蜍灵可诱导人类白血病K562，THP?1和HL?60等细胞凋亡 ［1-3］，为进一步研究蟾蜍灵诱导白血病细胞凋亡的分子生物学机理，本实验采用蟾蜍灵作用HL?60细胞，研究其对Bcl?2表达、裂解及磷酸化的影响，并探讨PKC活性及其同工酶表达在蟾蜍灵作用后的变化。
材料和方法
主要试剂
蟾蜍灵、碘化丙锭及RNase购于Sigma公司。蟾蜍灵用无水乙醇配成10-2 mol/L的原液，实验前用PBS稀释，将乙醇终浓度控制在体积分数＜0.01%。预实验表明，该浓度乙醇对细胞增殖没有影响。RPMI 1640培养液购于Gibco公司；胎牛血清购于医学院血液学研究所；小鼠抗人Bcl?2抗体购于Santa Cruz公司；兔抗人PKCα、βⅠ、βⅡ 抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体、马抗小鼠抗体均购于北京中山生物技术有限公司；兔抗人GAPDH抗体购于上海康成生物工程有限公司；［γ?P32］ATP购于北京亚辉生物医学工程公司； 100 bp DNA Ladder购于上海生工生物技术服务公司。
人髓性白血病HL?60细胞由Ueda教授（福井医科大学）提供，生长于含经56℃、30分钟灭活的10%胎牛血清、12 U/ml庆大霉素的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养。所有实验均采用对数生长期细胞。用1-100 nmol/L蟾蜍灵作用HL?60细胞0-72小时，采用台盼蓝拒染法测定细胞增殖能力并绘制增殖曲线。
细胞形态学分析
用不同浓度的蟾蜍灵作用HL?60细胞，制成细胞涂片，瑞氏?姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态。
流式细胞术解析
将细胞用冷PBS离心洗涤后，加入体积比为70%的冷乙醇，4 ℃过夜。加入RNase（200 μg/ml）37 ℃孵育1小时，在加入碘化丙锭（20 μg/ml）4 ℃避光30分钟后，进行流式细胞仪解析，采用CELLQuest软件进行细胞周期分析。
亚细胞成分的分离及PKC活性测定
离心收集5×107细胞，加入1 ml缓冲液A［20 mmol/L Tris?HCl （pH 7.4）、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L EGTA、 100 μg/ml PMSF、 2 μmol/L抑酞酶、 2 μmol/L胃酶抑素及0.25 mol/L 蔗糖］，超声粉碎5次，每次20秒，100 000 ×g离心1小时，上清为胞浆部分。在沉淀中加入1 ml含0.1％Triton 100的缓冲液A，按上述方法超声粉碎，4 ℃裂解30分钟后离心（同上），上清为含胞膜部分。用Lowry法测定蛋白浓度。将20 μl待测样品加入含［γ?32P］ATP的反应混合液30 μl中于30 ℃反应10分钟，取25 μl反应物点于Whatman P?81强阳离子交换滤纸上，在75 mmol/L磷酸溶液中洗3次终止反应，烘干后放入装有10 ml蒸馏水的液闪瓶中，用Beckman 1801型液闪仪进行液闪测定［4］。PKC的活性以30 ℃时每g酶蛋白每分钟催化［γ?32P］掺入底物蛋白的量，即nmol /（min·g）蛋白表示，总活性为胞浆与含胞膜部分活性之和。
DNA 凝胶电泳
离心收集2×106细胞，加入100 μl溶解缓冲液（20 mmol/L EDTA、 100 mmoll/L Tris(pH 8.0)、 0.8％ SDS）， 4 ℃放置10分钟。15 000×g离心5分钟后，在上清中加入RNase (终浓度为0.2 mg/ml)， 37℃孵育1小时，加蛋白酶K(终浓度为2 mg/ml)， 55 ℃过夜。加入异丙醇120 μl混匀后，12 000×g 离心10分钟，在沉淀中加入20 μl TE缓冲液混匀，室温下溶解30分钟后，在1.5％的琼脂糖中进行电泳（50 mV, 1.5小时）。电泳结束后EB染色，Tanon GIS 2020凝胶成像系统分析并拍照。
Western blot分析
将2×107个细胞裂解于含100 μg/ml PMSF、 2 μg/ml aprotinin 的 RIPA裂解液中（0.1% SDS、1% 脱氧胆酸钠、1% Triton?100、 150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris?HCl pH7.4），4℃裂解1小时， 15 000×g离心30分钟。取上清，采用Lowry法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白进行SDS?聚丙烯凝胶（凝胶浓度为Bcl?2：12%； PKC：7.5%），将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时，分别加入PKCα、βⅠ、βⅡ及Bcl?2抗体（稀释浓度为1∶800）及GAPDH抗体（稀释浓度为1∶5 000），过夜。加入碱性磷酸酶标记的二抗作用2小时（稀释浓度为1∶1000），显色后分析并拍照，用各指标平均强度与内参照GAPDH的比值代表蛋白表达的相对水平。
统计学处理
所有数据用3次独立实验的平均值表示，数据用均值加减标准差（±SD）表示，采用统计软件SPSS 10.0进行t检验。
结 果
蟾蜍灵抑制HL?60细胞增殖
用1-100 nmol/L蟾蜍灵处理HL?60细胞24，48及72小时，蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制HL?60细胞增殖(P <0.05)，24、48及72小时抑制细胞增殖50％的药物浓度（IC50）分别为(25.8±2.1)，(8.0±1.2)及(2.3±0.3) nmol/L（图1）。
Figure 1. Inhibition effect of bufalin on growth of HL?60 cells at different times.
蟾蜍灵诱导HL?60细胞凋亡
用50 nmol/L蟾蜍灵处理24小时，形态学观察表明HL?60细胞出现典型的凋亡形态学变化，表现为细胞核碎裂，并出现凋亡小体（图2）。50 nmol/L蟾蜍灵分别处理HL?60细胞6，12 及24小时，流式细胞仪解析表明，因凋亡形成的亚二倍体 (sub?G1) 细胞分别为15.4％，29.6％及52.5％（图3）。DNA琼脂糖凝胶电泳结果表明，蟾蜍灵作用6小时后DNA出现凋亡特异性的180-200 bp及其倍数的梯形条带（图4）。
蟾蜍灵对Bcl?2蛋白表达、磷酸化及裂解的影响
用50 nmol/L蟾蜍灵分别处理HL?60细胞6、8、12 及24小时，Western blot检测结果显示，在蟾蜍灵处理前Bcl?2条带上方存在磷酸化修饰带。蟾蜍灵处理8小时后，Bcl?2蛋白表达水平明显下降，同时在23 kD处出现裂解条带，并且磷酸化修饰条带也随蟾蜍灵作用时间的延长逐渐减弱（图5）。
Figure 5. Effect of bufalin at concentration of 50 nmol/L on Bcl?2 protein expression detected by Western blot. Lane 1: untreated cells. Lane 2: 6 hours. Lane 3: 8 hours. Lane 4: 12 hours. Lane 5: 24 hours.
蟾蜍灵短时间作用对PKC活性及同工酶表达的影响
以1、10、100 nmol/L 蟾蜍灵分别处理HL?60细胞30分钟后，PKC总活性分别为（18.5 ± 2.6），（17.1 ± 3.0），（19.8 ± 1.2）nmol /（min·g）蛋白，与未处理对照组的（19.2 ± 1.8） nmol/（min·g）蛋白相比没有明显变化（P>0.05）。Western blot分析结果显示，胞浆部分PKC βⅡ蛋白表达水平分别降至对照组的49.8％、19.2％及20.5％，含胞膜部分的表达量则明显增加，分别增至对照组的2.1倍、2.8倍及2.6倍。而PKCα、βⅠ蛋白在胞浆、胞膜中的表达没有明显变化（图6），提示蟾蜍灵短时间作用于HL?60细胞可促使PKCβⅡ由胞浆向胞膜转位。
Figure 6. Protein expression of PKCα,βⅠ and βⅡ in HL?60 cells treated with bufalin at different concentrations for 30 minutes assayed by Western blot. Lane 1: untreaed cells. Lane 2: 1 nmol/L. Lane 3: 10 nmol/L. Lane 4: 100 nmol/L. c: cytosolic fraction. m: membraneous fraction.
讨 论
Bcl?2是细胞凋亡抑制基因家族的成员之一，Bcl?2过度表达可抑制包括蟾蜍灵在内的多种刺激因素诱导的凋亡［5］。另一方面，Bcl?2的抑凋亡作用及其表达水平、与家族中促凋亡基因如Bax的比值、磷酸化状态、裂解及线粒体转位等多种因素有关。我们过去的研究证实，抑制Bcl?2的表达可增强肿瘤细胞对化疗药物诱导凋亡的敏感性［6］；蟾蜍灵在诱导HL?60细胞凋亡过程中下调Bcl?2的表达，降低Bcl?2/Bax比值［3］。Bcl?2蛋白裂解是一种翻译后修饰，研究表明，在多种凋亡刺激的作用下Bcl?2可发生裂解，产生具有Bax样促凋亡作用的23 kD片段［7］。本研究证实，在蟾蜍灵诱导HL?60细胞凋亡过程中，Bcl?2表达水平降低的同时也发生了类似的裂解。磷酸化是Bcl?2蛋白的另一种翻译后修饰，其对Bcl?2抑凋亡作用的影响目前尚存在争议。有研究表明，Bcl?2磷酸化是微管抑制剂等抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡所必需的［8,9］。但Du等［10］的研究表明，在微管抑制剂诱导的细胞凋亡中，Bcl?2的磷酸化与其抑凋亡作用有关，脱磷酸化则触发凋亡。Wang等［11］也报道，Bcl?2在一些白血病细胞中是以磷酸化的状态存在的，Bcl?2过度磷酸化能增强急性淋巴细胞白血病细胞JM1的化疗耐受性，而诱导JM1细胞凋亡则伴随Bcl?2的脱磷酸化。血管内皮生长因子通过Bcl?2磷酸化解救化疗诱导的原代急性淋巴细胞性白血病细胞凋亡。本实验首次证实，HL?60细胞中存在磷酸化状态的Bcl?2，在蟾蜍灵诱导细胞凋亡的过程中，Bcl?2表达下调的同时磷酸化水平降低，即发生脱磷酸化。虽然磷酸化状态对Bcl?2抑凋亡作用有影响，但目前负责Bcl?2磷酸化/脱磷酸化循环的蛋白激酶/磷酸酶系统尚不明确。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)通过活性增强或膜转位等方式激活并改变底物蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化状态，调节凋亡相关基因，其中包括调节Bcl?2的磷酸化状态［12?15］。我们过去的研究证明，在PKC激活剂TPA诱导的U937细胞凋亡过程中，Bcl?2表达降低［16］。PKC有12种同工酶分别参与细胞增殖、细胞分化及凋亡的调控，其作用因刺激因子、细胞内在固有程序、底物特异性及同工酶表达的不同而不同。一般认为，经典PKC（cPKC）与细胞增殖有关，但也有研究证实某些肿瘤细胞的凋亡伴有cPKC的活化。Laouar等［17］报道，PKC激活剂PMA可诱导HL?60细胞凋亡，而cPKCβ缺失的HL?60变异株则对PMA诱导的凋亡耐受，当cPKCβ表达载体转染后细胞又获得了对凋亡诱导的敏感性。也有人报道，cPKCβⅡ是PKC激活剂Gnidimacrin抗肿瘤效应所必需的［18］。但是，Whitman等［19］报道阿糖胞苷诱导HL?60细胞凋亡时，cPKCβⅡ发生的易位活化却与凋亡及Bcl?2的下调相拮抗，推测可能是凋亡的一种自限性机制。在本研究中，在蟾蜍灵短时间处理后PKC总活性没有明显变化，但cPKCβⅡ发生快速膜转位，随后出现了Bcl?2的脱磷酸化。本研究结果表明，蟾蜍灵诱导人类白血病HL?60细胞凋亡的机制可能与Bcl?2表达下调、裂解及脱磷酸化有关，并且cPKCβⅡ发生的膜转位活化可能参与了Bcl?2的脱磷酸化，但确切机制仍需进一步研究。
【】
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