慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
【摘要】 本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道（PPT）元件、泛醌启动子（PUB）和绿色荧光蛋白基因（GFP）连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV?G）共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流式细胞仪（FACS）观察感染情况。结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，病毒滴度测定为（3.09±0.61）×106 U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达，FACS分析转导效率为（37.98±6.26）%。结论：成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体，对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。
【关键词】 慢病毒载体 T淋巴细胞 绿色荧光蛋白基因
Expression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral Vector
Abstract This study was purposed to constructe the three?plasmid system of the lentiviral vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene and to investigate the expression of GFP in T lymphocytes of the mouse. The polypurine tract (PPT) element, ubiquinone promoter (PUB) and GFP were ligated to plasmid pLO134 using subcloning technology to construct plasmid pTK153. Human kideny 293T cells were co?transfected with the three?plasmid system containing packaging plasmid △NRF, plasmid pTK153 and envelope plasmid VSV?G by using calcium phosphate DNA precipation and the expression of GFP was observed under fluorescence microscope after 12 hours. The viral particles were collected after transfection 72 hours, were frozen at -80℃ and were used to infect mouse T lymphocytes at multiplicity of infection (m.o.i .) of 3. The expression of GFP in mouse T lymphocytes was observed by fluorescence microscopy and fluorescence?activated cell sorting (FACS). The results showed that the transfection efficacy was 63.04±7.24% in 293T cells analysed by FACS and the viral titer was (3.09±0.61)×106 U/ml. The expression of GFP was also evident in mouse T lymphocytes and the transduction efficacy was (37.98±6.26)%. It is concluded that the three?plasmid system of lentiviral vector containing GFP gene is successfully constructed and the transduction efficacy is high in mouse T lymphocytes.
Key words lentiviral vector; mouse T lymphocytes; green fluorescent protein gene
J Exp Hematol 2007; 15(1):125-128
逆转录病毒载体（retroviral vector， RV）系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因受到了一定的限制［1］。围绕这一问题，近年来人们把目光投向了来源于包括人类免疫缺陷病毒?1（human immunodeficiency virus?1， HIV?1）在内的慢病毒载体（lentiviral vector， LV）。LV最大的特点是可以感染非分裂期细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞等［2］。我们构建了以HIV?1为基础的LV三质粒系统，并以绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein gene， GFP）作为标志基因，观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。
LV三质粒系统的构建及鉴定
用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别从pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB启动子及GFP基因，用T4DNA连接酶依次将PPT元件、PUB启动子及GFP基因连接至由BamHⅠ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去除5'?P的载体pLO134上，连接产物转化感受态细胞DH5α，同时设立空白对照。37℃过夜培养，次日从连接板挑取6-8个克隆进行扩增培养，用Promega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒后，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ和AgeⅠ+XbaⅠ鉴定连接产物的正反向。包装质粒△NRF、包膜蛋白质粒VSV?G、pTK131、pTK145及pTK54均为本科徐开林教授构建。
慢病毒载体包装细胞系的建立
应用Ivitrogen 公司无内毒素的质粒中量提取试剂盒提取pTK153、△NRF及VSV?G用于转染。转染前24小时选择生长状态良好的293T细胞按1∶3传代，24小时后细胞生长达60%-70%汇合时采用磷酸钙沉淀法进行转染。将转移质粒pTK153 15 μg、ΔNRF 10 μg、VSV?G 5 μg、CaCl2 125 μl，补加消毒的双蒸水至500 μl，在涡旋混合器上边振荡边加入500 μl 2×BES，室温放置30分钟。将转染液加到培养板中，轻轻混匀，3% CO2、37℃培养箱中培养3小时后，加入血清使其终浓度为10%，12小时后更换完全培养基，5% CO2、37℃培养箱中继续培养，并在荧光显微镜下观察荧光表达情况及FACS测定GFP阳性率。
病毒滴度测定
在6孔板中分别接种2×105的293T细胞，将所收集的上清按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行系列稀释，将1 ml 稀释后的病毒液分别加入到相应的孔中，48小时后在荧光显微镜下观察各孔中GFP的荧光表达情况，计数表达GFP的细胞个数，乘以相应的稀释倍数即得到病毒滴度。
病毒颗粒感染小鼠T淋巴细胞
取BALB/c小鼠脾细胞，在RPMI 1640培养液中培养3天后，用台盼蓝染色法测定活细胞数，然后按2×106/ml细胞与包装好的慢病毒颗粒按m.o.i 1∶3感染病毒颗粒，共同培养，24小时后重复感染1次。48小时后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况或通过FACS计数GFP表达阳性率。
结 果
载体构建
从pTK131用BamHⅠ和BglⅡ切下154 bp的PPT元件，连接至pLO134的BamHⅠ后，经EcoRI单酶切后，获得的正向连接片段为170 bp、7745 bp，构建成pTK134（PPT元件）；再连接从pTK145切下的1224 bp的PUB启动子，用SacII单酶切鉴定，正向连接所得片段为560 bp、1212 bp和7367 bp，构建出pTK151（PPT+PUB）；最后连接从pTK54切下的780 bp的GFP基因，用AgeI和XbaI酶切鉴定，正向连接所得片段为800 bp和9125 bp，获得转移质粒pTK153（PPT+PUB+GFP）。
慢病毒载体的包装
用磷酸钙沉淀法将构建好的三质粒pTK153、△NRF及VSV?G转染293T细胞后，12小时在荧光显微镜下观察到293T细胞中表达绿色荧光（图1），证实了GFP基因的表达。转染72小时后荧光显微镜下再观察发现细胞中荧光强度较12小时时有所增强，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，从而建立了慢病毒载体系统的包装细胞系。
病毒滴度的测定
将转染72小时后包装细胞上清液再感染293T细胞，48小时后测定6孔板中慢病毒载体的滴度。在未进行超速离心的情况下，病毒滴度测定结果为（3.09±0.61）×106 U/ml。与常用的逆转录病毒载体的滴度相近，说明慢病毒载体包装后容易获得较高的病毒滴度。
感染T细胞情况
感染小鼠T淋巴细胞48小时后，荧光显微镜下观察到T淋巴细胞内含有绿色荧光（图2），证实GFP基因在其中的表达，FACS分析转导效率为（37.98±6.26）%，较本实验室同样条件下逆转录病毒载体感染小鼠T淋巴细胞的效率（23.2±3.5）%为高（P＜0.01）。
讨 论
作为基因中常用的靶细胞，T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞，在移植物抗宿主病等疾病中起到重要的作用。提高目的基因对T细胞的转导效率对于对这类疾病实施基因治疗具有重要的意义，这是目前研究的重点和难点。寻找新型的载体是其中的方法之一。常用的逆转录病毒载体对其转导效率较低，本实验室既往应用其转导T淋巴细胞转导效率为（23.2±3.5）%［3］，采用慢病毒载体后，转导效率达到（37.98±6.26）%，有较明显的提高。慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞，这是由其自身结构所决定的［4］。HIV?1为RNA双链分子，其单链由9 749个核苷酸组成，共有9个基因，除包括与简单逆转录病毒相同的gag、pol和env 3个编码病毒颗粒的基本结构基因外，还有2个调节基因tat和rev及4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef。在病毒复制的过程中，gag编码的基质蛋白、pol编码的整合酶和vpr辅助蛋白形成整合前复合物，其本身具有核定位信号，有利于整合前复合物进入靶细胞核，而不完全依赖靶细胞的分裂状态，此为慢病毒可感染非分裂细胞的主要机制［5］。
目前慢病毒多采用三质粒表达系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒，其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV?1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白（VSV?G），应用VSV?G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp的gag和RRE，并在其中插入目的基因。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生有复制能力野生型病毒的可能性。通过三质粒共转染293T细胞，超速离心后病毒滴度可达109 U/ml［6］。
在本实验中我们成功构建了以PUB启动子为内部启动子、GFP基因为标志基因的慢病毒载体的三质粒包装系统。三质粒系统中的包装质粒ΔNRF，内含人巨细胞病毒早期启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点；包膜蛋白质粒编码VSV?G。转移质粒中以GFP基因作为标志基因，利用GFP基因作为标志基因可以非常直观、方便地观察到实验结果，缩短了实验流程。将此三质粒转染293T细胞后，荧光显微镜下观察到了GFP的表达，建立了慢病毒载体的包装细胞系。病毒滴度的测定在未进行超速离心的情况下仍然达到106 U/ml，与常用的逆转录病毒载体滴度相近，说明应用慢病毒载体比较容易获得较高的病毒滴度，这对于进一步感染靶细胞获得较高的转导效率是至关重要的。
虽然我们试验中对T细胞的转导效率有所提高，但是要将其大规模应用还不能达到要求，分析其中原因可能与未进行超速离心浓缩病毒颗粒获得较高的病毒滴度以及未进行G418筛选等有关系。但G418筛选过程操作费时，工艺复杂，筛选过程中损失大量的T淋巴细胞是其缺陷，而加大病毒用量提高m.o.i.比率和重复感染的方法可以提高基因转导效率，但势必需要更多的病毒产出。有报道应用流动感染的方法可以提高病毒感染效率达90%［7］，操作简单、省时、病毒用量少、不需重复感染，对此我们将在以后的工作中作进一步的尝试。
【】
1Lundstrom K. Gene therapy applications of viral vectors. Technol Cancer Res Treat, 2004; 3: 467-477
2Kafri T, van?Praag H, Gage FH, et al. Lentiviral vectors: regulated gene expression. Mol Ther, 2000; 1: 516-521
3陈香梅, 徐开林, 潘秀英等. 携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究. 实验血液学杂志, 2005; 13:641-644
4Frankel AD, Young JA. HIV?1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem, 1998;67:1-25
5Cavalieri S, Cazzaniga S, Geuna M, et al. Human T lymphocytes transduced by lentiviral vectors in the absence of TCR activation maintain an intact immune competence. Blood; 2003;102:497-505
6Xu K, Ma H, McCown TJ, et al. Generation of a stable cell line producing high? titer self?inactivating lentiviral vectors. Mol Ther, 2001; 3:97-104
7Chuck AS, Palsson BO. Consistent and high rates of gene transfer can be obtained using flow?through transduction over a wide range of retroviral titers. Hum Gene Ther, 1996; 7: 743-750［］?μβαγ ±SD
