骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究
作者：毛平 曾进龙 王彩霞 杜庆华
【摘要】 为了探讨胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）联合细胞因子对脐血单个核细胞（MNC）中CD133+细胞的体外扩增作用，将新鲜脐血（CB）中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组：C组为空白对照组，不含基质细胞和细胞因子；S组为单用基质细胞组；F组为单用细胞因子组；SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0，6，10及14天检测有核细胞总数、CD133+细胞数及集落形成单位（CFU）数。结果表明：各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组；除了第14天外，SF组在第6、10天时CD133+细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论： 胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用，基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+细胞，这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。
【关键词】 骨髓基质细胞； 造血干细胞； 细胞扩增； CD133+细胞； 脐血； 细胞因子
In Vitro Expansion of Cord Blood CD133+ Cells Supported by Bone Marrow Stromal Cells and Cytokines
Abstract The aim of this study was to investigate the effects of human fetal bone marrow stromal cells (FBMSC) in combination with exogenous cytokines on supporting in vitro expansion of CD133+cells in cord blood mononuclear cells (MNC). MNCs separated from cord blood (CB) were cultured for up to 14 days in a serum?free system with FBMSC or exogenous cytokines or both of them. On day 0,6,10 and 14, total nucleated cells (TNC) were counted；CD133+ cells were quantified by FACS, and hematopoietic progenitor cells were assessed by semisolid culture assay. The results showed that the number of TNC was remarkably increased in FBMSC and cytokine group, the expansion of CD133+ cells and CFU were increased in FBMSC and cytokine group except that on day 14. It is concluded that FBMSC play an important role in delaying the differentiation of hematopoietic cells. FBMSC in combination with exogenous cytokines can promote the effective expansion of CB MNC and CD133+ cells, this expanding system may meet the needs for clinical application of expanded CD133+cells.
Key words bone marrow stromal cell; hematopoietic stem cell; cell expansion; CD133+ cell; cord blood; cytokine
CD34是目前造血干细胞（HSC）最常用的表面抗原标志。随着对HSC研究的深入，人们发现存在CD34抗原尚未表达的造血干细胞［1］，又发现部分AC133可能是比CD34更早表达的表面抗原［2，3］，在第七届人类白细胞分化抗原大会上AC133正式命名为CD133，CD133+细胞比CD34+细胞具有更高的增殖和自我更新能力［4］。我们利用本实验室已经建立的人胚胎骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系［5］，以脐血MNC为起始细胞，研究脐血CD133+细胞的体外扩增潜能。
材料和方法
主要试剂和仪器
羟乙基淀粉液（HES）购自美国B.Braun公司。人淋巴细胞分离液（Ficoll?Hypaque，密度1.077）购自天津灏洋公司。25 ml一次性塑料培养瓶购自美国Becton Dickinson公司。DMEM?LG培养液及胎牛血清（FBS）购自Gibco公司。青霉素和链霉素购自HyClone公司。无血清培养液使用Stem spanTM SFEM，造血祖细胞半固体培养基使用MethocultTMGF H4434，圴购自加拿大Stem Cell Technologies公司。干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶3类配基（FL）、血小板生成素（TPO）均购自英国PeproTech公司。CD133?PE购自德国Miltenyi Biotech公司。流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司FACS Vantage产品。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究胚胎骨髓基质细胞滋养层的建立
经家属知情同意后，取流产的胚胎（4-5月）3个。无菌条件下冲出骨髓液，经Ficoll离心后获得MNC，以1×106/cm2接种于5 ml的DMEM?LG培养液中（含有20% FBS， 100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素）。48小时后全量换液弃去悬浮细胞为原代细胞（F0），以后每隔5天进行半量换液。贴壁细胞融合达到80%时以0.05%胰酶消化传代后为F1，F3 至F5代的基质细胞,经15Gy γ射线照射,用于共培养，使用之前用PBS洗涤3次。
脐血MNC的制备
足月妊娠的健康产妇脐血，经病人及家属知情同意后取自本院，共10份，ACDA抗凝。所采脐血在4小时内按4∶1体积比与HES混匀之后静置30-45分钟沉淀红细胞，吸取上清经Ficoll密度梯度离心分离出单个核细胞（MNC），用PBS洗涤3次后备用。
脐血MNC的液体培养体系及实验分组
采用Stem SpanTM无血清培养体系，SCF、FL、TPO的终浓度均为50 ng/ml。实验分为4组：①C组：空白对照组，仅有培养基+MNC；②S组：基质细胞+MNC；③F组SCF+FL+TPO+MNC; ④SF组：基质细胞+SCF+FL+TPO+MNC。脐血MNC的接种密度为1×106/ml，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。分别在第6、10、14天进行半量换液，检测细胞总数和CFU数，用流式细胞术检测CD133表达的情况。所得数值与第0天数值为1.00的相应数值作比较。
造血祖细胞集落培养
将细胞按2×105/ml接种到24孔板MethocultTMGF H4434半固体培养液中，内含1%甲基纤维素、30% FBS、 1% BSA、 10-4mol/L 2?ME、 50 ng/ml rhSCF、 50 ng/ml GM?CSF、 10 ng/ml rhIL?3、 3 U/ml rhEPO。造血祖细胞集落培养第14天时在倒置显微镜下CFU集落数。
细胞表面标志的流式细胞术检测
流式细胞试剂有CD133?PE单克隆抗体.。流式细胞仪检测每个样品收1×104个细胞。使用CellQuest软件系统进行分析。
统计处理
用SPSS统计软件进行分析，结果以±SD表示，差异显著性采用方差分析。
结 果
胚胎骨髓基质细胞滋养层的建立
胚胎骨髓细胞经全量换液后，贴壁细胞经7-9天培养后即达到80%融合，主要为长梭形的成纤维细胞，原代细胞尚可见少量圆形贴壁细胞及黏附于贴壁细胞表面的造血细胞。经2次传代以后成纤维细胞得以纯化，呈平行或旋涡状生长。经γ射线照射后，基质细胞能在Stem spanTM SFEM无血清培养液中继续培养18-20天而不发生脱落，台盼蓝染色显示活力>95%。
脐血、MNC、CD133+细胞数
所采集脐血的容量平均为65.7 ml (52-92 ml),收集的MNC数为（1.2±1.3）×108个，新鲜脐血MNC中CD133+细胞的所占比例为（0.92±0.31）%。
培养过程中有核细胞总数的变化
C组、F组在培养过程中有核细胞总数一直呈下降趋势，尤其C组下降迅速，第6天的有核细胞总数为第0天的0.55±0.20，至第14天仅剩0.14±0.07。F组有核细胞数的下降速度较平缓，分别为0.92±0.30、0.88±0.29和0.66±0.36，但组内不同时间点比较均无差异（P>0.05）。S组在第6天有所下降，为第0天值的0.87±0.32，之后则一直增加，但增幅小，虽然第6天和第14天差异明显（P<0.01）,但在相邻时间点即第6天与第10天，第10天与第14天比较时均P>0.05。SF组在第6天、第10天细胞总数明显扩增，第10天达到组内最高值，为第0天值的2.29±0.73，第14天略有下降，为第0天值的2.19±0.66，但跟第6天比较并不明显（P>0.05）。
在相同的时间点里，SF组有核细胞总数的扩增倍数均比其它组要高（P<0.05）（附表）。
CD133+细胞数变化
C组、F组CD133+细胞数虽然在第6天都有所增加，但之后即第10天和第14天均已低于初始水平，C组在第14天CD133+细胞基本已经消耗殆尽。S组和SF组在第6天，第10天都保持着增长的趋势，S组在第6天、第10天分别为第0天值的（4.06±1.44）倍和（4.51±1.87）倍，两个时间点比较差异无显著性（P>0.05），第14天回落至第0天的（1.60±0.85）倍，比第6天和第10天都要低（P<0.05）。SF组在第6天达到组内峰值，为第0天值的14.49±3.41倍，在第10天有所回落，但仍为第0天值的10.43±3.31倍，但在第14天快速下降，为第0天值的1.19±0.53倍。除了在第14天SF组与S组扩增的倍数无统计差异（P>0.05），SF组在第6天、第10天的扩增倍数均比其它各组在相同时间点要高出许多（P<0.05）（附表）。
各组培养后CFU数的变化
各组在第6天、第10天CFU数都有所增加，但C组在第14天已观察不到CFU。F组在第14天回落至大致第6天水平（P>0.05）。S组在培养过程中CFU数一直在增加，第14天达到组内最高值，为第0天值的17.46±3.42倍，组内各时间点比较P值均<0.01。SF组在第10天CFU数达到组内最高值，为第0天值的10.92±1.95倍，跟第6天、第14天比较均有显著差异（P<0.01）；第14天回落至（6.49±2.57）倍，跟第6天相比差别没统计意义（P>0.05）。在相同时间点内，除了第14天S组为最高外，其余时间点均为SF为最高（P<0.05）（附表）。
讨 论
过去几十年，最广泛应用的HSC表面抗原标志是CD34。但随着对HSC研究的不断深入，人们发现CD34-细胞也具有自我更新和造血重建的能力［1］。1997年，两个独立的研究小组［2,3］分别报道了HSC新的一种表面抗原标志即AC133。2003年召开的第七届人类白细胞分化抗原大会上AC133正式命名为CD133。CD133不仅在HSC中表达，而且在内皮祖细胞、神经干细胞等早期阶段的细胞中亦有所表达［6,7］。CD133+ 造血细胞能在胎羊模型中成功地实现了一次、二次移植［2］。 CD133+CD34+细胞在NOD/SCID小鼠移植模型中，不仅能够重建髓系造血，还表现出T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的表型［8,9］。临床实践也表明，CD133+ HSC的移植是安全的、可行的［10,11,12］。
目前许多研究者对HSC扩增的研究都是使用分离纯化的CD34+细胞或者CD133+ 细胞。对细胞分选之后进行培养，虽然能够获得较大的扩增倍数，而且扩增效果也较稳定［13］，但CD34+细胞能由CD133+ CD34-细胞体外培养产生［14］，而CD133+细胞也可能经由CD133-细胞产生［15］。因此分选细胞不可避免地造成CD34+细胞或者CD133+细胞的丢失，同时也可能丢失比它们更加早期的造血细胞。而用于移植的脐血主要是以单个核细胞或全血的方式来储存的，脐血造血干细胞移植的植入速度也主要和整个有核细胞数有关［16］。所以，本实验选用脐血MNC作为培养的起始细胞。
我们的研究发现，单用SCF+TPO+FL细胞因子组合培养脐血MNC时，虽然CD133+细胞能得到一定量的扩增，但有核细胞总数都一直呈下降的趋势。其原因可能是我们所用的细胞因子都是一些早期作用因子，在扩增早期HSC的同时，较晚期阶段的造血细胞很快就衰老死亡。CFU和CD133+细胞检测的数据也表明，单用细胞因子也造成了早期HSC的迅速耗竭。
在单用基质细胞的实验组中，有核细胞总数和CD133+细胞都有一定的扩增，但增幅较小。初期6天有核细胞总数有所下降，但同时期CD133+细胞则是有所扩增。推测是因为CD133+早期造血细胞主要是处于G0/G1期［17］，细胞进入增殖周期需要一定的时间，而这一时期的晚期阶段造血细胞衰老死亡较快。经过14天的培养后，单用基质细胞组的CFU计数一直上升为第0天值的17.46±3.42倍，体现出基质细胞对延缓造血细胞的分化的重要作用。
联合使用基质细胞和细胞因子时，有核细胞总数得到有效扩增的同时，CD133+细胞也得到了显著的扩增，比单用基质细胞或者单用造血因子都有明显的优势。在有核细胞总数的扩增方面，单用基质细胞总的趋势是扩增，单用细胞因子时是一直在下降，联合使用基质细胞和细胞因子组合时，则呈增加的趋势，这说明两者合用具有协同促进造血细胞增殖的效果。在进行造血干细胞移植时，我们需要的不仅是能长期造血的早期的造血干细胞，而且需要有助于短期内迅速恢复造血的处于较晚期阶段的造血祖细胞［18］。所以，基质细胞联合细胞因子可能是比较接近临床使用要求的扩增脐血的方法。
单份脐血的容量及所含的HSC有限，不能够满足体重较大的儿童和成人患者的移植需要，对造血细胞进行体外扩增是有望解决这个问题的方法之一。Jaroscak等［19］用封闭的持续灌注的细胞培养系统扩增脐血造血细胞后进行Ⅰ期临床试验，虽然移植体外扩增后的细胞并不改变红系、粒系和血小板的植入时间，但观察期间输注的扩增后的脐血细胞对患者是安全、无毒性的。因此深入研究造血细胞增殖和分化的调控因素，改进细胞扩增的体系和方法，对脐血HSC移植有重要的意义。
【】
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