低剂量rhG?CSF对56例非血缘供者外周造血干细胞动员
作者：李佩 张国芸 朱苹 吴蓓倩 牛强 谢毅
【摘要】 本研究观察低剂量人重组粒细胞集落刺激因子(rhG?CSF)对非血缘健康供者的影响，探讨用于中华造血干细胞捐赠者资料库提供的非血缘健康供者外周造血干细胞动员方案。56例非血缘健康供者接受rhG?CSF 5 μg/（kg·d)皮下注射，在动员第4、5两天或第5、6两天采集干细胞，观察动员效果及不良反应，检测动员前后血常规指标、CD3+、CD4+、CD8+和CD20+细胞比例；对采集物进行单个核细胞（MNC）和CD34+细胞计数；对所有供者随访至2006年5月31日。结果显示： 在rhG?CSF动员过程中出现1级毒副作用(按WHO分级标准):腰背酸痛17.9％(10／56)、焦虑失眠8.9％(5／56)、疲乏4．5％(3／56)等，无需特殊处理，无需终止动员。第4、5两天采集和第5、6两天采集所得的MNC分别是（5.95±1.52）×108/kg和（7.19±2.12）×108/kg； CD34+细胞分别是（3.03±1.09）×106/kg和（7.92±2.50）×106/kg。血红蛋白水平、血小板量、CD3、CD4、CD8、CD20百分比动员前后无变化。结论： 5 μg/（kg·d) rhG?CSF用于非血缘健康供者的动员是安全而有效的。
【关键词】 粒细胞集落刺激因子； 外周血； 造血干细胞动员； 非血缘供者
Peripheral Blood Stem Cell Mobilization with Low Dose rhG?CSF in 56 Unrelated Healthy Donors
Abstract The study was aimed to observe the effect of recombinant human granulocyte?colony stimulating factors (rhG?CSF) in low dose on peripheral blood stem cell (PBSC) mobilization in unrelated healthy normal donors. G?CSF was administered at 5 μg/（kg·d) subcutaneously for successive 5 or 6 days to 56 unrelated donors. Stem cells were harvested on the fourth and fifth days or on the fifth and sixth days.The numbers of mononuclear cells (MNC), CD34+cells and Hb, Plt, and CD3+, CD4+, CD8+ and CD20+ cells were determined during the mobilization. The results showed that most common adverse events were bone pain (17.9%,10/56)， agrypnia (8.9%,5/56) and lassitude (4.5%,3/56) during rhG?CSF mobilization， but all donors were suffeved less than grade 2 according to the WHO criteria, and did not need to stop the mobilization and not neeed to give speeial treantment. In harvest on day 4-5 and 5-6, MNC count was (5.95±1.52)×108/kg and (7.19±2.12)×108/kg； CD34+ cells count was (3.03±1.09)×106/kg and (7.92±2.50)×106/kg. There were no significant differences in hemoglobin level and platelet count, the percentage of CD3+ cells, CD4+ cells, CD8+ cells cells and CD20 cells between pre?and post?mobilization of rhG?CSF. It is concluded that the low dose of rhG?CSF 5 μg/（kg·d) for peripheral blood stem cell mobilization in unrelated healthy normol donors is safe and effective.
Key Words granulocyte?colony stimulating factor； peripheral blood hematopoietic stem cell mobilization; unrelated donor
J Exp Hematol 2007; 15(2):
异基因造血干细胞移植是血液系统恶性疾病和一些遗传性疾病的有效方法，国际骨髓移植登记组（IBMTR）的统计资料显示，全球范围每年约开展15 000例异基因造血干细胞移植，其中30%为非血缘供者的异基因移植［1］。我国实行独生子女政策，HLA配型相合的同胞供者日益减少，临床上对非血缘健康志愿供者的的造血干细胞（HSC）需求日益增加。正常人外周血干细胞（PBSC）的含量很低，必须通过粒系集落刺激因子动员，才能采集到移植所需的PBSC量。因此，造血干细胞动员和采集技术是Allo?PBSCT成功的关键技术之一。 我们从1996年完成国内首例非血缘外周血干细胞移植起，已经为中华造血干细胞捐赠者资料库完成非血缘健康供者外周造血干细胞动员采集56例，现将资料分析如下。
材料和方法
供者
男性30例，女性26例，中位年龄24（18-45）岁，体重62.95±8.78 kg（45-82 kg）。实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)低剂量rhG?CSF对56例非血缘供者外周造血干细胞动员所有供者均为自愿加入中华骨髓库的非血缘供者，与受者HLA配型一致或1-2个位点不合。体格检查除外感染性疾病、慢性系统性疾病及其他不适于捐献的情况，事先均签署知情同意书。所有供者随机分为2组： 第4、5两天采集组（25例）和第5、6两天采集组（31例），两组在性别、年龄、身高、体重方面均无显著差异。
外周血检查
每日取臂静脉血检测外周血血小板量、血红蛋白水平、白细胞数及CD34、CD3、CD4、CD8、CD20细胞数。
造血干细胞动员
皮下注射rhG?CSF (非格司亭，惠尔血) 5 μg/kg,持续3或4天，在第4、5天和第5、6天开始采集外周血干细胞，一般连续采集2天。采集当天改为采集前2小时肌肉注射G?CSF 5 μg/kg，以增加骨髓中的造血干细胞向外周血液的释放。
造血干细胞采集
使用Baxter3000plus血细胞分离机，按干细胞程序进行分离，流速40-50 ml/min，循环血量10-12 L，产物容量50 ml。4℃保存，24-48小时内输注。采集过程中及时静脉注入10%葡萄糖酸钙以缓解大量枸橼酸钠抗凝剂导致的低钙血症的症状。采集物取1 ml计数单个核细胞(MNC)、CD34+细胞及CD3、CD4、CD8、CD20细胞。
临床观察及随访
观察供者在rhG?CSF动员及分离过程的中、后期出现的不良症状，并按WHO毒副作用分级标准评价和记录出现的不良症状及其消失时间、缓解方式。本组病例均进行追踪随访，随访中位天数16.50(1-118)月。
统计学处理
数值以 士 SD表示，动员前后数据比较采用成组资料t检验，使用SAS 8.2软件进行分析。
结 果
毒副作用
毒副作用极其轻微，少数供者在rhG?CSF动员过程中出现1级(按WHO毒副作用分级标准)的腰背酸痛(10／56)、焦虑失眠 (5／56)、疲乏 (3／56)等副作用，仅予以安慰及心理疏导，无需特殊处理，也无需终止动员。停止药物动员后上述症状均消失。因采集过程中常规给予葡萄糖酸钙，供者在采集过程中均无四肢、口唇及颜面麻痹、胸闷、抽搐等低钙症状出现。采集后所有供者都有不同程度的劳累感，休息后均快速缓解。所有供者1周后随访血常规指标均恢复到动员前水平； 1年后健康体检无异常改变；追踪随访中位数16.50(1-123)月，无相关不良事件发生。
外周血象改变
供者外周血有核细胞、血红蛋白、血小板、CD34、CD3、CD4、CD8、CD20等在动员前后改变如表1所示。动员前有核细胞计数为（6.20±2.11）×109/L ,采集前白细胞计数为（28.88±1.06）×109/L,是动员前的4.66倍（P<0.0001）。CD34+细胞比例动员前（0.03±0.017）%，采集前为（0.11±0.110）%（P<0.0001）。其余指标变化无统计学差异。
采集结果
供者随机分为2组，第1组第4、5两天采集，第2组第5、6两天采集。两组供者在年龄、性别、体重等方面无差异（表2）。第二组采集的MNC和CD34细胞量比第一组多。所有接受外周血CD34+细胞的患者均获得造血功能重建。
影响外周血干细胞采集的诸因素我们分别以性别、年龄、动员前白细胞计数、动员前CD34+细胞比值、采集前白细胞计数、采集前CD34+细胞比值、采集前单个核细胞比例以及不同的动员天数作为自变量，MNC和CD34+细胞数作为因变量进行了单因素分析，结果显示：不同的动员天数对MNC和CD34+细胞数有影响（P值为=0.0224和<0.0001）。为同时控制其他影响因素对结果的影响，我们采用了协方差分析, 经过变量筛选后（取0.05显著性水平），多因素分析的结果是：采集前白细胞计数和不同的动员天数对采集的MNC数有显著影响（P值分别为=0.0495和0.0090）， 这两个因素也是对采集的CD34+细胞数的影响因素（P值分别<0.0001和<0.0001）。
讨 论
在非血缘健康志愿供者捐赠外周血造血干细胞的动员过程中，外周血造血干细胞动员采集的安全性意义重大。随着国内造血干细胞资料库的扩大和供受者间HLA配对成功率的上升，非血缘供者造血干细胞动员和采集已在全国范围内的开展，非血缘健康志愿供者的安全性日益受到重视。rhG?CSF动员是当前采用的主要方法,EBMT推荐剂量为10 μg/kg，连续运用4-6天，即可得到足够数量的造血干细胞［2］。不良反应轻微，通常包括：骨痛（54%）、头痛（52%）、不适（49%）、失眠（28%）、恶心（15%）、多汗（14%）、其他流感样症状（12%）、发热（6%）［3］。但国内外报告， G?CSF动员中已发生下述少数严重不良反应，引起国人对我国非血缘健康志愿供者安全的忧虑： ①死亡：国外有1例同胞供者动员中因为血栓形成（急性心肌梗死和卒中）而死亡，这可能与血小板的G?CSF受体有关［4］；还有3例供者因外周血干细胞动员而诱发镰刀性贫血危象，出现休克、心脏骤停死亡［5］； ②脾脏破裂：国外报道4例脾脏破裂［6］，国内天津也报告了1例同胞供者在G?CSF动员后采集造血干细胞的过程中发生脾破裂； ③自身免疫疾病的发作［7］，如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、甲状腺功能减退等； ④捐献干细胞后血象异常持续较长时间。
为避免以上严重不良反应，确保供者安全，应严格地进行供者的健康检查。不应接受脾大者、年龄偏大有心血管疾病可能者、有风湿病史者、血常规指标异常或有血象异常史者作为供者。发生脾破裂的供者G?CSF使用剂量均为10 μg/（kg·d)或更大的剂量［6］，本组使用G?CSF(非格司亭，惠尔血)的剂量为推荐剂量一半： 5 μg/（kg·d)，注射4-6天。通常认为，（4-6）×106/kg CD34+细胞是用于移植的最佳剂量［3］，本组采集CD34+细胞数平均达到了（4.31±2.02）×106/kg。56例动员的外周血造血干细胞均植入成功，受者获得造血功能重建，未发生失败事件。动员后白细胞计数上升的水平有限，但副作用比较轻微。动员采集后对所有供者均追踪随访，最长达123月（中位数16.50月），均无相关的长期不良事件发生，其中3例供者正常结婚生育。由此我们认为，低剂量、短程rhG?CSF（惠尔血）动员是安全且有效的。
我们的动员采集结果显示，有9例CD34+细胞<2.0×106/kg，平均CD34+细胞仅为（1.54±0.45）×106/kg。 但该9例受者移植后都获得造血重建，且达植活标准需要的天数较少。这与MNC数较大，平均为（5.71±1.02）×108/kg有一定的关系。MNC是一个综合的造血干细胞数量的标志，不仅包含了CD34+细胞，还包含了CD34-细胞。输入受者体内的造血干细胞达到一定数量是成功植活的保证，从采集的有效性和可靠性来考量，要求采集物的CD34+细胞大于2.0×106/kg。 如采集的CD34+细胞总量<2.0×106/kg，而此时MNC细胞数>5×108/kg，因可获得足够数量的CD34-造血干细胞，有补充CD34+细胞数量不足的作用。
我们的数据显示，年龄、性别、动员前白细胞数、动员前CD34+细胞的比值、采集前CD34+细胞的比值、采集前单个核细胞比值等对采集的结果都没有影响。与Croop等［8］结论一致。
我们的多因素分析提示，采集前白细胞数是MNC数和CD34+细胞数的影响因素。白细胞过高会引起白细胞淤滞，ASH会议2005年建议，动员时白细胞计数大于（70-75）×109/L，应减低非格司亭的剂量，所以不宜用提高白细胞数的办法来提高干细胞的采集量。我们的单因素和多因素分析都提示不同的动员天数是MNC数和CD34+细胞数的影响因素。我们资料比较表明，第5、6两天采集组（31例）比第4、5两天采集组（25例）采集效果好。但动员的天数并非越长越好，我们的实验研究表明，动员时间长于8天，干细胞会出现归巢（homing），采集效果下降［9］。此外，如果动员天数过长，因G?CSF总剂量过大，引起不良反应可能会增加。所以，G?CSF 5 μg/（kg·d）肌肉注射，第5,6天连续2天采集外周血干细胞，采集前2小时肌肉注射G?CSF 5 μg/kg，是一种比较合理的动员和采集方案。
随着中华造血干细胞捐赠者资料库的进一步扩大，以及非血缘供患者间配对成功的增多，我们有必要进一步研究外周造血干细胞动员的安全性，绝对地避免严重不良事件的发生，以有利于非血缘健康志愿供者队伍的壮大。当前，安全、合理和有效的低剂量短程rhG?CSF动员方案是值得推荐的。
【文献】
1Bakken R, van?Walreaven AM, England T， et al. Donor commitment and patient needs. Bone Marrow Transplant, 2004;33:225-230
2Suzuya H, Watanabe T, Nakagawa R， et al. Factors associated with granulocyte colony?stimulating factor?induced peripheral blood stem cell yield in healthy donors. Vox Sang, 2005; 89:229-235
3Anderlini P, Donato M,Chan K?W, et al. Allogeneic blood progenitor cell collection in normal donors after mobilization with filgrastim: the M.D. Anderson Cancer Center experience. Transfution, 1999; 39:555-560
4Bensinger W, Buckner CD, Rowley S, et al. Treatment of normal donors with recombinant growth factors for transplantation of allogeneic blood stem cells. Bone Marrow Transplant, 1996;17(Suppl 2):S19-S21
5Grigg AP. Granulocyte colony?stimulating factor?induced sickle cell crisis and multiorgan dysfunction in a patient with compound heterozygous sickle cell/beta+ thalassemia. Blood, 2001;97:3998-3996Stroncek D, Shawker T, Folman D, et al. G?CSF induced spleen size changes in peripheral blood progenitor cell donors. Transfusion, 2003;43:609-613
7Bonsignore MR, Morici G, Santoro A, et al. Circulating hematopoietic progenitor cells in runners. J Appl Physiol, 2002;93:1691-1697
8Croop JM， Cooper R， Seshadri R， et al. Large?seale mobilization and isolation of CD34+ cells from normal donor. Bone Marrow Transplantation， 2000; 26：1271-1279
9陈彤，谢毅. VLA?4整联蛋白和造血细胞迁移之间的相关关系研究. 实验血液学杂志， 2003;11: 230-234
