急性白血病患者LRP、GST?π、MRP1蛋白表达及临床意义
作者：黄彬涛 肖镇 石玉涛 哈森 赵卫红 高大 阎晓红 杨宏新
【摘要】 本研究探讨谷胱甘肽硫转移酶?π（GST?π）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）、肺耐药相关蛋白（LRP）与急性白血病（AL）多药耐药（multi?drug resistance, MDR）的关系、并探讨这3种耐药蛋白表达的相关性以及三者表达与AL患者临床特征的关系。采用免疫组织化学S?P法检测80例AL患者及30例正常人GST?π、MRP1及LRP的表达。结果表明： GST?π, MRP1, LRP蛋白表达均与临床耐药相关，3种耐药蛋白表达阳性组的完全缓解率均低于阴性组，提示耐药蛋白表达时白血病患者预后不良。GST?π、MRP1在AL难治组中的表达具有高度相关性。结论： GST?π/ MRP1二者联合检测对评定白血病预后不良较单独测定某一蛋白更具有显著的临床意义。当外周血白细胞数≥10×109/L时，LRP阳性表达率显著增高，提示LPR对高白细胞数白血病患者的耐药性和预后评定具有很高的判断价值。
【关键词】 急性白血病； 谷胱甘肽硫转移酶?π； 多药耐药相关蛋白； 肺耐药相关蛋白； 多药耐药
Expressions of LRP，GST?π and MRP1 in Acute Leukemia Patients and Its Clinical Significance
Abstract This study was purposed to investigate the relationship of expressions of gluthatione?S?transferase?π（GST?π）, multidrug resistance protein?1 (MRP?1), lung resistance protein (LRP) with multidrug resistance of acute leukemia (AL), the correlation between 3 kinds protein expressions and the correlation of their protein expression with clinical features of AL patients. The S?P immunohistochemical staining method was used to determine the expressions of GST?π， MRP1 and LRP proteins in 80 AL patients and 30 normal subjectes. The results showed that there was the correlation between GST?π, MRP1, LRP protein expression and chemotherapy resistance, meanwhile CR rates of patients with positive expression of those proteins were lower than that of patients with negative expression (P<0.05), so those protein expressions may be accounted for poor prognosis. There was the positive relationship between expression of GST?π and MRP1 in refractory group (r=0.851, P<0.01). It is concluded that co?examination of GST?π and MRP1 has greater significance than examination of one kind of protein in evaluating poor prognosis of leukemia patients. LRP protein expression increase obviously when WBC counts≥10×109/L (63.6%, P<0.05), therefore LRP protein has great judging value for evaluating drug resistance and prognosis of acute leukemia patients whose peripheral blood WBC counts were high.
Key words acute leukemia; GST?π; LRP; MRP1; multidrug resistance
化疗是目前急性白血病（AL）主要的手段，其中存在的关键问题是肿瘤细胞对化疗药物产生抗药性，这种现象由多种机制所致［1］。多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐受，对其它结构、作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐受。本研究用免疫组织化学S?P法检测患者外周血中谷胱甘肽硫转移酶?π（GST?π）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）、肺耐药相关蛋白（LRP）的表达，探讨三者与AL多药耐药的关系及三者在AL中的表达是否存在相关性，以便对白血病患者预后、化疗效果进行评估，为临床化疗方案的调整、耐药蛋白逆转剂 的使用提供重要依据，进一步查明急性白血病MDR产生的机制。
材料和方法
研究对象
2005年度内蒙古医学院附属、内蒙古自治区医院的急性白血病住院患者或门诊患者80例，其中男性 42例、女性38例，年龄16-65岁，中位年龄37.2岁。对照组为30例健康成年人，男性 12例、女性18例,年龄18-65岁，中位年龄41.5岁。患者均经门诊血液细胞室骨髓象细胞计数和FAB分类法［2］标准确诊。对急性非淋巴细胞白血病患者主要采用DA（柔红霉素、阿糖胞苷）、HA（高三尖杉酯碱和阿糖胞苷）方案，对急性淋巴细胞白血病患者主要采用CODP（环磷酰胺、长春新碱、柔红霉素和糖皮持激素）、COMP（环磷酰胺、长春新碱、米托蒽醌、糖皮质激素）方案化疗。
80例白血病患者中，选择27例符合FAB诊断标准的初诊患者，在接受标准方案化疗前采集血标本作为初治组。其余53例初治与复发的白血病患者，经两个疗程标准方案化疗后采集血标本，按照张之南血液病诊断及疗效标准 ［3］ ，将他们分为未缓解组（29例）、完全缓解组（24）例。
药品和器材
鼠抗人单克隆GST?π、MRP1抗体、免疫组织化学S?P试剂盒均购自福州迈新生物技术公司，Ficoll淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。超净工作台为北京半导体设备厂产品，LD4?2型电动离心机为北京医用离心机厂产品，电动离心涂片机（型号：tp?2）为郑州医疗器械厂产品，电热压力蒸汽灭菌器（型号：SYQ.DSX?280）为上海申安医疗器械厂产品，电热干燥箱（型号：SY）为天津市三水仪器有限公司产品、低温冷冻冰箱为日本三洋公司产品，光学显微镜和荧光显微镜为日本OLYMPUS产品。
外周血有核细胞的提取
抽取外周静脉血5 ml，加入肝素盐水溶液1 ml（250 U/ml）抗凝，向抗凝血中加入等体积的Hank缓冲液(pH=7.4)，血标本缓慢置于等体积的人淋巴细胞分离液，离心机离心，吸管抽取有核细胞层悬液，反复加入Hank缓冲液，纯化有核细胞悬液，用血细胞计数板计数悬液中的细胞数，调整细胞浓度为(1-2)×106/ml。离心涂片机涂片，丙酮液固定，将涂片置于-20℃冰箱冷冻保存。
外周血有核细胞涂片的免疫组织化学S?P检测法［4］
每张涂片加50 μl过氧化物酶阻断液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS缓冲液冲洗，加50 μl正常非免疫动物血清，室温下孵育10分钟。 每张涂片滴加50 μl单克隆一抗（抗Pgp、LRP、Bcl?2抗体），以PBS液替代一抗作为空白对照，4℃冰箱存放过夜。PBS缓冲液冲洗，每张涂片滴加50 μl生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟。PBS缓冲液冲洗3次，每张涂片滴加50 μl链霉素抗生物素?过氧化物酶溶液，室温下孵育10分钟。PBS缓冲液冲洗，每张涂片滴加100 μl新鲜配置的DAB溶液。显微镜下观察细胞着色情况3-10分钟。自来水冲洗，苏木素复染5分钟，PBS缓冲液冲洗返蓝，经梯度乙醇脱水后中性树胶封片。
结果判定
高倍（×1000）显微镜下对每张涂片计数500个有核细胞，以GST?π阳性细胞百分率＞2%判断为GST?π表达阳性［5］。以MRP1阳性细胞百分率＞3%判断为MRP1表达阳性［6］，LRP阳性着色细胞占计数细胞的百分率≥15%为蛋白表达阳性［7］。GST?π表达阳性细胞在胞浆出现棕黄色着色，MRP1阳性细胞胞浆和（或）胞膜出现棕黄色着色，LRP阳性表达标志是细胞浆呈棕黄色颗粒 ［8］。
统计学分析
应用统计软件SPSS 10.0对计数资料采用χ2检验、四格表精确概率法进行数据分析，以直线相关法分析耐药蛋白阳性率之间的相关性，双侧P≤0.05为统计学显著性差异，双侧P≤0.01为统计学极显著性差异。
结 果
GST?π、MRP1和LRP的表达
结果见表1。采用精确概率法3种耐药蛋白表达阳性率，发现其在正常人群对照组与急性白血病初治组之间存在极显著差异（P＜0.01）。
GST?π、MRP?1、LRP的表达与完全缓解率的关系
采用两独立样本四格表、χ2检验可知，53例初治组、复发组白血病患者经过2个疗程标准方案化疗后，3种耐药蛋白阳性表达者与阴性表达者之间完全缓解率均存在显著性差异（P＜0.05）（表2）。
采用精确概率法计算出化疗后的白血病患者GST?π/ MRP1、GST?π/LRP、MRP1/LRP、GST?π/ MRP1/LRP共同表达阳性者与阴性者之间完全缓解率均存在极显著性差异（P＜0.01）（表3）。
GST?π和MRP1的表达关系
对AL难治组GST ?π和MRP1的表达进行直线相关分析，结果发现相关系数 r=0.851（P<0.01），提示两者的表达呈密切正相关（附图）。
以MRP1阳性表达率为自变量X，GST?π阳性表达率为应变量Y，两者之间回归方程为Y=1.23+0.95X，进一步假设检验P=0，即回归方程式成立，两变量之间存在依存关系。
LPR表达与外周血WBC量的关系
研究中发现，LPR表达阳性率与外周血白细胞数的多少存在很大关系，当外周血白细胞计数>10×109/L(白细胞增多性白血病)与外周血白细胞计数≤10×109/L时，二者之间LPR阳性表达率存在显著性差异（P<0.05）（表4）。
讨 论
急性白血病抗肿瘤化学中的主要问题是白血病细胞对化疗药物产生耐药［9］。目前国内外普遍认为，白血病细胞多药耐药性是导致白血病复发、难治、化疗失败的主要原因 ［10、11］。GST?π介导的多药耐药机制越来越受到人们的关注，它与其他耐药途径的关系，尤其是与膜转运蛋白的关系尚需进一步研究来证实［12］。GST?π参与体内烷化剂、脂过氧化物、DAN氢过氧化物及细胞毒物质产物的自由基的解毒过程，其解毒作用机制是催化药物与谷胱甘肽（GSH）结合。本研究表明，30例正常对照组未见GST?π阳性表达。初治组与正常对照组之间GST?π表达存在极显著差异，这提示GST?π表达与白血病原发耐药可能相关。对急性白血病患者采用标准方案化疗后，GST?π阳性表达增高者，完全缓解率低，表明GST?π表达与急性白血病患者的低完全缓解率有关。
MRP1属于依赖ATP的膜转运蛋白，通过将药物由胞内转至胞外而导致耐药。本研究表明，30例正常对照组未见MRP1阳性表达。初治组与正常对照组之间MRP1表达存在极显著差异，这提示MRP1表达与白血病原发耐药可能相关。本研究观察到一部分无GST?π、MRP1的高表达的患者仍表现出临床耐药，急性白血病MDR发生机制仍有待进一步研究阐明。对急性白血病患者采用标准方案化疗后，MRP1阳性表达增高者，完全缓解率显著降低，表明MRP1表达与急性白血病患者低完全缓解率有关。
LRP的耐药机制是使以胞核为靶点的药物不能通过核孔进入胞核，或者把药物泵入细胞内囊泡再以胞吐的方式将药物排出细胞。LRP在肿瘤组织中的表达率明显高于正常组织［13］。本研究中30例正常对照组外周血中存在1例LRP表达阳性者，但27例白血病初治组中有10例表达阳性，二者之间阳性表达率存在极显著差异，提示LRP表达也与白血病原发耐药可能相关。对于化疗后的白血病患者，LRP阳性表达增高时完全缓解率显著降低，表明LRP表达亦与急性白血病患者低完全缓解率有关。经标准方案化疗后3种耐药蛋白单独表达的检测证明，Pgp、LRP、Bcl?2阳性表达时，急性白血病患者完全缓解率降低，提示3种耐药蛋白表达均为急性白血病预后不良的指标。Leith等［14］对352例急性髓细胞性白血病患者的研究表明，LRP在43%病例中表达阳性，随白血病细胞计数增加而表达率显著增高。本研究针对80例急性白血病患者LRP表达检测发现，外周血白细胞数>10×109/L的白细胞增多性白血病患者，LRP阳性表达率显著增高，特别是外周血白细胞数＞15×109/L时,LRP阳性表达率达到72.73%。因此，LRP对于白细胞增多性白血病患者耐药性和预后的评定具有更高的判断价值。
有关急性白血病 GST?π与MRP1表达的关系，目前研究尚少。一般认为，化疗药物只有与GSH偶联才能被转运至肿瘤及白血病细胞外［15］，MRP1为GST?π转运出细胞的通道即膜泵［16］。Den Boer ［17］认为，GST?π与MRP1表达之间不存在相关性；姚尔固等［18］研究认为，两者之间存在相关性。本研究直线相关分析表明两者存在高度相关性（r =0.851， P< 0.01），证实了GST?π与MRP1导致MDR的机制间可能存在某些联系，因此两者联合检测能明显提高耐药判断和预后评定的符合率，同时也表明临床耐药性的产生不是由一种耐药蛋白引起，往往是由多种蛋白共同表达起作用的结果。尽管GST?π/LRP、MRP1/LRP联合表达阳性者白血病化疗后完全缓解率极显著降低，但是LRP与GST?π、MRP1之间阳性表达率没有统计学意义的相关性，因此LRP能否作为评定白血病临床耐药性及预后不良的独立因素有待进一步研究评价。
目前研究发现，糖皮质激素、消炎痛、利尿酸、维生素C有逆转GST?π介导的MDR作用，维拉帕米、奎宁、胺碘酮、利舍平等有逆转MRP1介导的MDR作用。LRP不仅对经典的MDR药物（蒽环类、生物碱、表鬼臼毒素等）产生耐药，还可对非Pgp和MRP介导耐药的顺铂、卡铂、烷化剂等药物产生耐药［19、20］。逆转剂治疗旨在全部或部分恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。较为常见的逆转剂有维拉帕米、环胞菌素及其类似物，但因其毒性较大而限制了其临床应用。近来研究发现，将化疗药物与某些大分子物质（多肽、葡聚糖等）交联也可实现药物的靶向给药，同样有利于多药耐药性的逆转。国内外实践表明，大剂量化疗与干细胞移植通过提高血药浓度，促进细胞内药物增加，也可达到克服多药耐药性的作用。免疫组织化学S?P法操作相对简单且费用较低，适合临床广泛应用，因此今后临床工作中可针对耐药蛋白阳性表达的患者适当选用逆转剂治疗或调整联合化疗方案、加大用药剂量，符合移植条件的白血病患者尽可能在患病早期接受干细胞移植治疗，以提高白血病患者长期生存率和治愈率。
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