门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究
作者：罗长缨 李本尚 帖利军 顾龙君
【摘要】 细胞内门冬酰胺合成酶（asparagines synthetase， AS）的表达水平与白血病细胞对左旋门冬酰胺酶（L?asp）耐药有关。本研究旨在通过筛查发现AS启动子区的单核苷酸多态性（SNP）位点，研究它们对AS基因表达量的影响及寻找对L?asp反应具有影响的个体遗传因素。 对82份白血病标本和45份非白血病标本直接测序，筛查AS启动子区的SNP；用实时定量PCR法测定相应标本中的AS mRNA水平。通过对被筛SNP位点不同基因型个体的AS表达水平的统计分析，判断被筛SNP是否对基因表达产生影响。结果发现： 被测AS启动子片段内共发现3个SNP位点。分别是-239C/T，-92G/A和-62A/T。其中-92A等位基因在白血病患儿中的发生频率高于非白血病(P<0.05)。AS表达在该SNP的各种基因型个体间存在差异，基因表达水平由高到底依次为GA杂合子型>AA纯合子型>GG纯合子型（P<0.01）。结论： -92A等位基因变异可能与白血病的某些特征相关，并且这个等位基因变异的存在与AS基因的高表达相关。
【关键词】 急性白血病； 门冬酰胺合成酶； 启动子区； 单核苷酸多态性
Single Nucleotide Polymorphism in the Promoter Region of Aspa?ragine Synthetase and Its Impact on the Gene Expression
Abstract High expression of cellular asparagine synthetase (AS) is a causative factor for the resistance of leukemic cell to L?asparaginase therapy. This study was aimed to find single nucleotide polymorphism (SNPs) in the promotor region of asparagine synthetase (AS) gene and to determine if these SNPs have influence on the transcriptional activity of AS promotor. The DNA sequences of AS promoter (pAS) from 82 leukemic children and 45 controls were determined to screen for SNPs in this region and the AS mRNA level in these samples was quantified using real?time PCR assay. The results indicated that three SNPs were found in the sequenced pAS fragment. They were ?239C/T， ?92G/A and ?62A/T respectivdy. The frequency of ?92A allele was higher in leukemic samples than that in nonleukemic control (P<0.05). The gene expression level differed among the individuals with genotype of the ?92G/A SNP, and the descending order was as follows: GA heterozygote>AA homozygote>GG homozygote. It is concluded that some features in leukemia might associate with SNP on ?92A locus, and this SNP in pAS can be one of the factors influencing transcriptional activity of AS gene. The existence of the ?92A allele variant contributes to a high expression of AS gene.
key words acute leukemia; asparagine synthetase; promotor region; single nucleotide polymorphism
左旋门冬酰胺酶（L?asp）是儿童急性淋巴细胞白血病(ALL) 和T细胞性淋巴瘤化疗方案的重要组成部分。对L?asp耐药的ALL患儿往往长期预后较差［1，2］。L?asp作用机制是通过分解血浆中的天门冬酰胺和谷氨酰胺，导致细胞内氨基酸的缺乏从而抑制细胞的增殖。然而大多数细胞通过表达门冬酰胺合成酶(asparagines synthetase, AS)利用细胞内的天门冬氨酸、谷氨酰胺和ATP重新合成上述氨基酸从而维持细胞生命和增殖。已有研究证实，细胞内AS的表达高低与细胞对L?asp的耐药密切相关［3, 4］。
此外，L?asp在临床上为一个引起较多严重不良反应的化疗药物，因此围绕该药药物疗效和药物代谢方面个体差异的研究有着重要的意义。本研究旨在筛查人群中AS基因调控区的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP)，并研究这些。
材料和方法
研究对象
82份白血病患儿骨髓标本取自诱导缓解治疗之前，其中3份为复发白血病标本。临床病例包括ALL 53例，ANLL 26例，CML 3例。骨髓形态学检查显示，4份标本的幼稚细胞比例低于70%，8份在70%-80%之间，剩余70份标本的幼稚细胞比例均在80%以上。非白血病标本45份，其中6份为骨髓，其余为外周血。
研究方法
基因组DNA抽提 用TRIZOL试剂（Invitrogen公司产品）抽提骨髓标本总RNA，同时抽提DNA。外周血标本的DNA用酚氯仿法抽提。
AS启动子片段的扩增 AS基因全长序列从Ensemble网站下载。扩增片段范围从转录起始点上游（-297 bp）至第一内含子内（+225 bp）,全长523 bp。引物用Primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程公司合成。上游引物： 5'? CCTCACGCATCAGTTTCTTA?3'；下游引物：5'?TCCTCCACCCCTTCCTTCCG?3'。用TaKaRa的LaTaq with GC Buffer kit进行扩增，体系为25 μl，循环参数： 94℃ 30秒；56.5℃ 30秒；72℃ 45秒，35个循环。扩增片段由英骏生物技术公司进行电泳分离纯化及序列测定。因部分标本在割胶后仍显示非特异序列的干扰，对这些标本进行巢式PCR，第一轮扩增后的产物以1∶50稀释，取0.5 μl加入第二轮扩增体系。第二轮PCR的上游引物同第一轮，下游引物： 5'?AAGCAGGTCAGGGTGATGTGGC?3'，片段长度424 bp。扩增体系25 μl: 10×buffer (Mg2+plus) 2.5 μl, dNTP 0.25 mmol/L, 引物各0.2 μmol/L, ExTaq HS(5 U/μl) 0.125 μl。循环条件： 94℃ 2分钟启动HS ExTaq，然后94℃ 变性30秒，55℃退火 30秒，72℃延伸45秒，循环35次。
骨髓细胞RNA提取及cDNA合成 骨髓单个核细胞按TRIZOL试剂说明书提取总RNA。RNA沉淀用含无RNase的DNase I溶液［TaKaRa，体系为每50 μl溶液中，10×DNaseI buffer 5 μl, DNase I (5 U/μl) 2 μl, RNase inhibitor(40 U/μl) 0.5 μl,其余为DEPC水］重悬并根据吸光值调整浓度至1 μg/μl。 37℃孵育20分钟后置冰浴。每份标本取2 μl模板进行反转录。反转录体系20 μl,模板2 μl先70℃变性10分钟，再加入18 μl反转混合物（各成分及浓度按Promega试剂说明），45℃延伸45分钟。最后95℃加热5分钟。反转录产物用双蒸水稀至100 μl保存在-20℃。
AS mRNA的实时荧光定量PCR/Taqman探针法测定 AS和内参照GAPDH的cDNA序列从GenBank获取。探针和引物序列（表1）用Primer Express 2.0软件设计后由TaKaRa公司合成标记。实时定量PCR的体系为25 μl: 5×Buffer 5 μl, dNTP 0.3 mmol/L, Mg2+ 5 mmol/L, ExTaq HS(5 U/μl) 0.25 μl, cDNA 5 μl,引物各0.3 μmol/L，探针0.12 μmol/L。循环条件： 95℃ 5分钟激活ExTaq酶，然后每个循环95℃ 15秒，60℃退火加延伸45秒，进行45个循环。标准曲线用HepG2细胞的cDNA以1∶4倍比稀释建立，标准品模板和待测模板均以复管进行扩增。扩增反应在ABI Prism 7000序列探测仪上进行。AS和内参照的起始模板量值用相对定量双标准曲线法分别算出。AS mRNA的定量用AS的起始模板量除以内参照的起始模板量的比值表示。
统计学处理
各SNP在不同标本组中的频率分布差异用R×C表、χ2检验。各组间AS mRNA定量差异用成组多样本秩和检验。
结 果
AS基因转录控制区SNP的检测
AS基因据已公布的数据有3种转录剪切方式。本研究以转录本NM?183356 5'端1号外显子第1个碱基为＋1。按已有报道，AS的转录调控核心区位于-88—+120，主要为1号外显子及其上游区域，此区为AS基因基础转录和受氨基酸缺乏上调表达所需的最小序列范围［5］。本研究扩增的片段范围为-297—+126，共发现3处 SNP位点。其中2个转换，分别是-239C/T， -92G/A； 1个颠换，-62A/T。-239C/T已为dbSNP数据库公布（rs3757676），-92G/A和-62A/T为新发现的SNP位点。-92AA（变异型纯合子）全部与-239CC（野生型纯合子）偶联。-239TT（变异型纯合子）则全部与-92GG（野生型纯合子）偶联。
3个SNP位点在白血病和非白血病患儿基因组中的分布频率
-239C/T和-62A/T的基因型频率和等位基因频率在白血病和非白血病组之间无显著差异。-92G/A 各基因型频率和等位基因频率在白血病和非白血病组间存在统计学差异（两种频率的P值均为0.012），其变异型等位基因A在白血病组的发生率高于非白血病组（表2）。
-92A变异型等位基因在淋、髓两系白血病患儿的频率均高于非白血病组（P值分别为0.041和0.01）。而两系白血病之间的-92G/A两种频率比较没有差异（P值分别为0.446和0.422）（表3和表4）。
根据AS启动子片段中SNP基因型AS mRNA水平的分组比较
-239C/T、-92A/T、-62A/T 3个变异位点并不存在连锁不平衡，因此我们按每个SNP位点的不同基因型对AS mRNA进行分组，统计分析各组间AS mRNA水平差异。-62A/T的T等位频率很低，总共只有3例A/T杂合子，所以我们仅对-239C/T和-92A/T 2个位点的SNP各基因型AS mRNA的转录水平进行差异分析，对白血病和非白血病两组共88份标本同时进行了测序和AS mRNA的测定，这些标本是合并进行统计分析的。
-239C/T位点各基因型个体间的AS mRNA表达水平没有统计学差异。而-92A/T位点的3种基因型的AS mRNA表达存在统计学差异，其杂合子GA型的AS mRNA表达水平最高，其次为变异型纯合子AA型，野生型纯合子GG型的AS mRNA水平最低（表5）。
讨 论
根据Aslanian等［3］的研究，对L?asp耐药的Molt?4细胞的AS mRNA水平显著高于Molt?4母株，并且AS mRNA升高的水平与AS蛋白量及酶活性相平行。通过逆转录病毒将外源AS cDNA导入Molt?4母株，可以看到后者产生与耐药株相同的表型。因此可以认为，AS mRNA的水平与细胞对L?asp耐药相关。本研究的目的在于分析个体遗传背景在L?asp反应中的作用。因此我们选择从AS基因的启动子SNP筛查入手来进行此项研究。AS基因转录调控区域为包含1号外显子在内的整个5'端部分。但其关键的调控部位在围绕转录起始点周围的200-300 bp的序列内，此间包括3个SP结合位点和2个营养素调控必需元件，前者控制AS的基础转录，后者调控有关氨基酸缺乏时的AS上调反应［5-7］。这些元件的序列在人和动物间高度保守，因此这些序列内部发生变异的可能性很小，否则将导致氨基酸反应和AS 转录的缺失［8］。这些序列以外的单核苷酸变异可能通过影响调控蛋白的结合或产生新的蛋白结合位点而影响AS的转录。
在我们所筛查的范围中共发现3处SNP。在对3个SNP的频率统计中，我们发现-92A等位基因型在白血病中的发生率显著升高。通常发现1种SNP在两组中存在分布频率差异有3种可能的原因： ①由于抽样误差导致的假阳性结果； ②该SNP位点与疾病相关基因存在连锁不平衡； ③SNP位点所在基因就是疾病相关基因。白血病是一种影响基因组DNA重组修复和细胞增殖分化凋亡等系统或途径的多基因疾病，其受累的主基因可能有上百条。这些基因间又互相牵制形成复杂的功能，单个基因的变异作用微小，疾病的某一性状往往是一系列主基因上的变异组成的SNP群产生的结果。因此虽然我们不能完全排除抽样误差的可能性，但后两种可能性也是存在的。首先，AS蛋白涉及细胞周期的调控。人的AS基因最初被克隆和定位是在寻找G1期调控相关的功能基因时完成的，AS突变致蛋白功能缺失，导致ts11细胞停滞在G1期，转入含有后来被确认为相当于人AS基因的序列后使得ts11细胞的周期得以完成［9］。而癌症的发生无不伴随这种或那种细胞周期调控基因的功能改变。因此我们不能完全排除AS基因中某个核苷酸的变异导致白血病等癌症发生几率增加的可能性。反过来解释，由于癌症细胞的修复系统功能异常所导致的基因组不稳定，可能导致单个变异型核苷酸的发生几率高于正常细胞。
本研究对-92G/A位点SNP 各基因型个体的AS表达水平统计分析结果显示，基因表达水平由高到低依次为GA杂合子型>AA纯合子型>GG纯合子型。由于AA纯合子例数在被统计的88份标本中仅占7例，因此我们推测，如果样本数量足够大，实际的AA纯合子的AS表达水平可能会高于GA杂合子型。不管怎样，-92A变异型等位基因的存在与AS的高表达相关。这一点已在我们的体外实验中得到证实（资料尚未发表）。
综合上面的结果，我们提出以下设想： AS蛋白按已有的报道具有促进细胞周期进展的功能［9］，并且L?asp作用于细胞后导致细胞周期被阻滞在G0/G1期［10］。AS启动子区-92A变异型等位基因的存在可能导致AS的表达量增加，从而使得细胞容易克服G1期的检测点完成整个周期。这种对细胞周期的正调控有可能对癌症的发生或耐药起到一定的作用。
【】
1Kaspers GJ, Veerman AJ, Pieters R, et al. In vitro cellular drug resistance and prognosis in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1997; 90:2723-2729
2Asselin BL, Kreissman S, Coppola DJ, et al. Prognostic significance of early response to a single dose of asparaginase in childhood acute lymphoblastic leukemia. J Pediatr Hematol Oncol, 1999; 21: 6-12
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4Hutson RG, Kitoh T, Moraga Amador DA, et al. Amino acid control of asparagine synthetase: relation to asparaginase resistance in human leukemia cells. Am J Physiol, 1997; 272 (5 Pt 1): C1691-1699
5Guerrini L, Gong SS, Mangasarian K, et al. Cis? and trans?acting elements involved in amino acid regulation of asparagine synthetase gene expression. Mol Cell Biol, 1993; 13: 3202-3212
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8Zhong C, Chen C, Kilberg MS. Characterization of the nutrient?sensing response unit in the human asparagine synthetase promoter. Biochem J, 2003; 372 (Pt 2):603?609
9Greco A， Ittmann M， Basilico C. Molecular cloning of a gene that is necessary for G1 progression in mammalian cells. Proc Nat Acad Sci, 1987; 84:1565-1569
10Ueno T, Ohtawa K, Mitsui K, et al. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L?asparaginase. Leukemia, 1997;11:1858-1861
