联合应用细胞遗传学、巢式RT?PCR和FISH技术检测慢性髓系白血病治疗过程中的肿瘤负荷
作者：王慧萍 李国霞 乔振华 王宏伟
【摘要】 本研究探讨常规细胞遗传学(conventional cytogenetics, CC)、巢式逆转录?聚合酶链反应(nested?reverse transcriptase polymerase chain reaction, nested?RT?PCR)及双色双融合荧光原位杂交(dual?color and dual?fusion fluorescence in situ hybridization, D?FISH) 三种技术监测慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者造血干细胞移植过程中肿瘤负荷的灵敏度和特异性。联合应用CC、巢式RT?PCR 和D?FISH三种技术对7例CML患者非清髓性异基因干细胞移植治疗前后的肿瘤负荷水平进行检测。检测结果显示： 7例CML患者治疗前后的40份骨髓标本中，有29份标本检出不同比率的Ph染色体；3份因细胞数少CC分析失败；36份标本RT?PCR检测结果为阳性。病例1移植后12、18、26及38个月的4份标本Ph染色体及RT?PCR结果均为阴性。病例1移植后9、10个月、病例2移植后15个月、病例3移植后12个月的4份Ph(-)bcr/abl(+)标本经FISH检测，分别检出5.4%、 0%、 16.5%及1.5%的bcr/abl(+)细胞。病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份标本因细胞数少而CC核型分析失败，对其行FISH检测，结果bcr/abl(+)细胞检出率分别为55.0%、27.5%和73.5%。病例1移植后12个月Ph(-)bcr/abl(-)的标本行FISH检测，结果bcr/abl(+)细胞检出率为0%。结论： CC可作为监测CML患者治疗过程中肿瘤负荷水平的基本手段。在移植后早期细胞数太少而无法进行CC检测，以及治疗病人体内肿瘤负荷降低到CC不能检出而RT?PCR仍为阳性时，借助FISH准确检测体内肿瘤负荷，以监测其动态变化。FISH检测bcr/abl转阴的病人需靠灵敏度更高的RT?PCR监测核定。
【关键词】 慢性髓系白血病；细胞遗传学；聚合酶链反应；荧光原位杂交
Detection of Tumor Load in Chronic Myeloid Leukemia During Treatment with Transplantation by Conventional Cytogenetics, Nested?RT?PCR and FISH
Abstract This study was purposed to investigate the sensitivity and specificity of conventional cytogenetics (CC),nested?reverse transcriptase polymerase chain reaction (nested?RT?PCR) and dual?color / dual?fusion fluorescence in situ hybridization (D?FISH) technique in monitoring the tumor load of chronic myeloid leukemia (CML) during treatment with transplantation. CC, nested?RT?PCR and interphase D?FISH were simultaneously carried out to detect the tumor load of 7 CML patients during treatment with non?myeloablative allogentic stem cell transplantation(allo?NSCT).40 specimens from 7 CML patients before and after allo?NSCT were analyzed. The results showed that 29 specimens were Ph(+) with different positive ratio and 3 specimens with lower cells were not analyzed by CC. 36 specimens were bcr/abl mRNA (+) by RT?PCR. 4 specimens from case 1 at 12，18，26 and 38 months after allo?NSCT were Ph(-) and bcr/abl mRNA (-),4 Ph(-)bcr/abl(+) specimens containing 2 from case 1 at 9 and 10 months after allo?NSCT, 1 from case 2 at 15 months after allo?NSCT, 1 from case 3 at 12 months after allo?NSCT showed 5.4%, 0%, 16.5% and 1.5% bcr/abl(+) cells by FISH. 3 specimens with lower cells containing 2 from case 5 at 20 and 60 days after allo?NSCT and 1 from case 7 at 40 days after allo?NSCT were analyzed by FISH and showed 55.0%, 27.5% and 73.5% bcr/abl(+) cells. The Ph (-) bcr/abl(-) specimen from case 1 at 12 monthss post?allo?NSCT showed 0% bcr/abl (+) cells by FISH. It is concluded that CC can be used as a basic tool to monitor the change of tumor load in CML during treatment. When specimen with lower cells can not be analyzed by CC in early period after allo?NSCT, or result of CC can not evaluate precisely dynamic change of tumor load and when tumor load in treated patient are lower to Ph(-) by CC while bcr/abl mRNA (+) by RT?PCR, FISH must be used to detect precisely tumor load and monitor dynamic change of it. More sensitive RT?PCR is used to monitor tumor load when it is lower to bcr/abl(-) by FISH during treatment.
Key words chronic myeloid leukemia; cytogenetics; polymerase chain reaction; fluorescence in situ hybridization
Ph染色体是慢性髓系白血病（CML）的标志染色体，其本质是t(9;22)(q34;q11)易位，易位的结果使位于9号染色体长臂3区4带 (q34) 上的c?abl原癌基因与22号染色体长臂上一个功能未明的断裂点簇集区(breakpoint cluster region, BCR)发生拼接，形成bcr/abl融合基因。易位形成的Ph染色体及相应的bcr/abl融合基因是CML发病的分子基础，也是CML的恶性克隆标志。在评价CML对各种治疗如INF?α、骨髓移植、格列卫等的反应程度时，准确判断患者骨髓细胞中的肿瘤负荷十分重要。我们联合应用常规细胞遗传学(CC)、巢式逆转录?聚合酶链反应(nested?RT?PCR)及双色双融合荧光原位杂交(D?FISH)技术对7例非清髓性异基因干细胞移植治疗的CML患者的肿瘤负荷水平进行检测，探讨3种技术对监测CML患者治疗过程中肿瘤负荷的灵敏度和特异性。
病例
7例CML患者系我院血液科2001年9月-2005年1月就诊的住院病人,均符合《血液病诊断及疗效标准》临床诊断标准，其中男性5例,女性2例，年龄19-56岁，中位年龄38岁。7例患者均行非清髓性异基因干细胞移植，术后根据临床反应及嵌和体形成情况给予供体淋巴细胞输注。阴性对照为3例健康供体骨髓细胞,阳性对照为K562细胞。
常规细胞遗传学分析
采用骨髓直接法和(或)24小时短期培养法按常规制备染色体并进行Ｒ显带核型分析。染色体核型异常按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》(1995)进行描述,每份标本至少分析10个中期细胞。
bcr/abl融合基因转录本的巢式RT?PCR检测
巢式RT?PCR按我室常规方法进行。外测引物序列为：C:5′?GCTTCTCCCTGACATCCGTG?3′，D:5′?CGAGCGGCTTCACTCAGACC?3′内测引物序列为：A:5′?CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG?3′，B:5′?CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA?3′，每次实验均设阳性和阴性对照，只有阳性对照为阳性，阴性对照为阴性时结果才视为可靠。
bcr/abl融合基因的D?FISH法检测［1］
bcr/abl融合基因探针 LSI BCR?ABL D?FISH探针由美国Vysis公司提供。
FISH检测 取出保存于 -20℃的染色体标本,换上新鲜固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)滴片, 室温气干后放入37℃预温的2×SSC中30分钟，分别在70%、85%、100%的乙醇(体积比)中室温梯度脱水,每梯度2分钟, 晾干。 在73℃变性液(70%的甲酰胺/2×SSC)中变性5分钟, 70%、85%、100%冰乙醇(-20℃)系列脱水, 每梯度2分钟, 晾干备用。将1 μl混合探针与9 μl杂交稀释液（hybridization buffer，购自Vysis公司)混合,在73℃水浴中变性5分钟, 然后加在染色体标本上,盖片封胶, 放入预热的湿盒中, 37℃杂交过夜。杂交后标本在73℃ 0.4×SSC/0.3% Triton?100中洗涤2分钟,再用2×SSC/0.1% Triyon?100室温洗涤1分钟, 避光晾干后加10 μl二氨基酚吲哚(DAPI)复染标本, 20分钟后荧光显微镜检测。
荧光显微镜检查 在Nikon?E600荧光显微镜下通过三色滤光块(DAPI/TRITC/FITC)观察杂交信号,每例至少分析200个间期细胞,不计数重叠细胞，阳性细胞的百分比率。FISH结果判断标准:红色(red, R)信号为abl,绿色(green, G)信号为bcr,将R信号与G信号重叠或接触定义为融合信号(fusion, F), 融合信号在荧光显微镜下呈黄色，为bcr/abl或abl/bcr融合基因。具有典型t(9;22)易位的细胞显示2个黄色的融合信号和1个红色及1个绿色信号(2F1R1G),而正常细胞则显示2个分离的红色信号和2个分离的绿色信号(2R2G)。
结 果
正常分界值的确定
正常分界值的取值为正常对照组中所观察到的阳性细胞数平均值+3个标准差(分界值=X+3SD)［1-3］,阳性细胞率大于分界值的标本我们将其定义为异常。本研究阴性对照组D?FISH检测到阳性细胞率为0%-0.5%,平均值0.17%,标准差0.24%,分界值为0.17%+3×0.24%=0.89%。K562细胞用D?FISH重复2次检测,阳性率为100%。
移植前后CC、RT?PCR及FISH检测结果
对来自7例CML患者非清髓性异基因干细胞移植前后的40份骨髓标本进行了检测，其中29份标本检出有不同比率的Ph染色体，8份Ph染色体阴性,3份因细胞数少CC分析失败。36份标本RT?PCR结果为阳性，包括29份Ph(+)标本、3份CC分析失败标本及4份Ph(-)标本。病例1移植后12、18、26及38个月的4份标本Ph染色体及RT?PCR结果均为阴性。对来自病例1移植后9及10个月、病例2移植后15个月、病例3移植后12个月的4份Ph(-)bcr/abl(+)标本进一步行FISH检测，分别检出5.4%、0%、16.5及1.5%的bcr/abl(+)细胞。对病例5移植后20、60天和病例7移植后40天的3份因细胞数少即CC核型分析失败的标本行FISH检测。bcr/abl(+)细胞检出率分别为55.0%、27.5%和73.5%。对病例1移植后12个月Ph(-)bcr/abl(-)的标本行FISH检测，结果为bcr/abl(+)细胞检出率为0%（附表）。
讨 论
95%以上的CML具有ｔ(9;22)(ｑ34;ｐ11)易位, 易位形成的Ph染色体及相应的bcr/abl融合基因是CML发病的基础。因此Ph染色体和bcr/abl融合基因是CML诊断、疗效观测和微小残留病监测的有效指标。在评价CML对各种治疗如INF、骨髓移植等的反应程度时，从定量角度准确判断患者骨髓细胞中的肿瘤负荷有重要的临床意义。研究表明［4］,病人骨髓或造血干细胞移植后残留肿瘤负荷的水平提示了疾病复发的可能性大小。目前进行定量研究常用的检测手段有CC、FISH和实时定量PCR等［5-7］。我们应用这3种技术对7例非清髓性异基因干细胞移植治疗中CML患者的肿瘤负荷水平进行了检测。
对7例CML患者非清髓性异基因干细胞移植治疗前后的 40 份骨髓标本检测发现， 移植后早期(3个月)由于细胞数少，CC分析往往不敏感，甚至失败。对病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份因细胞数少CC核型分析失败的标本行FISH检测，bcr/abl(+)细胞检出率分别为55.0%、27.5%和73.5%，可见在移植后早期用FISH可以准确检测体内肿瘤负荷水平，从而判定是否成功植入。移植后3个月至CC检测Ph染色体转阴前阶段，可以用CC对体内肿瘤负荷进行动态监测。当应用CC检测Ph(-)而用RT?PCR检测bcr/abl(+)时，应该用FISH监测体内肿瘤负荷的动态变化。我们对病例1移植后9、10个月、病例2移植后15个月、病例3移植后12个月的4份Ph(-)bcr/abl(+)标本进一步行FISH检测，分别检出5.4%、0%、16.5%及1.5%的bcr/abl(+)细胞，说明CC检测Ph转阴后，体内仍可能有一定数量的微小残留病存在。病例1移植后10个月Ph(-)bcr/abl(+)标本及移植后12个月Ph(-)bcr/abl(-)的标本行FISH检测，bcr/abl(+)细胞检出率均为0%，提示FISH检测bcr/abl转阴的病人需靠灵敏度更高的RT?PCR监测，一旦RT?PCR结果呈阳性，即需配合FISH监测，以便及早发现病情变化，实施干预措施。
我们的研究还发现，非清髓性异基因干细胞移植后病人体内Ph（+）细胞残留时间较长，但这并不意味着移植失败。大多数病人随者时间延长及辅以供体淋巴细胞输注(DLI)，Ph（+）细胞会逐渐减少并最终消失。其原因可能是嵌合的供者T淋巴细胞通过识别宿主残留细胞的次要组织相容性抗原（mMHC）或残留的抗原呈递细胞（DC）提呈递的白血病相关抗原，活化并产生移植物抗白血病反应(graft versus leukemia,GVL)，从而清除宿主体内的肿瘤细胞或遗传学异常的造血干细胞。T 细胞、NK细胞协同参与了GVL效应，CD4+ T细胞在GVL效应中起主要作用，CD8+ Tc2亚群细胞可介导GVL效应并在降低移植物抗宿主病（GVHD）发生率的同时防止移植物被排斥。这与非清髓性预处理干细胞移植后实施供者淋巴细胞输注后产生的效应一致［8-10］。
移植后病人体内残留的Ph（+）细胞比率下降不明显、停滞甚至有增高趋势时，应实施临床干预。病例6移植后8个月仍残留70%的Ph（+）细胞，多次给予DLI, Ph（+）细胞比率反复升降，效果不好，后又辅以干扰素治疗，效果仍然不好。目前病人仍处于血液学缓解期，正在考虑二次移植。
另外，移植成功也并不意味着病人就一定能够长期生存。病例2移植后Ph（+）细胞渐降，并于移植后15个月CC检测Ph转阴，但病人一般状况却一直不是很好，有严重的慢性移植物抗宿主病（cGVHD）表现,最终于移植后22个月因骨转移而死亡。由于病人一直处于血液学缓解期，骨髓检查并无复发倾向，所以我们考虑其骨转移可能早在移植前就已发生，提示移植要把握好时机，及早进行。病例5为一老年患者，年龄56岁，移植前已进入加速期，但移植非常成功，移植后5个月Ph（+）细胞就降至20%，术后发生cGVHD，于术后1年死于间质性肺炎。因此，如何防治cGVHD成为移植成功的关键之一。
综上所述，CC、RT?PCR和FISH 3种方法在检测CML病人对治疗的反应时各有其特点：①CC可作为监测CML患者治疗过程中肿瘤负荷水平的基本手段；②在移植后早期细胞数少时，CC检测结果无法准确判断体内肿瘤负荷动态变化时，以及治疗病人体内肿瘤负荷降低到CC不能检出而RT?PCR仍为阳性时，需借助FISH来准确检测体内肿瘤负荷，监测其动态变化；③FISH检测bcr/abl转阴的病人需靠灵敏度更高的RT?PCR监测。根据病人所处的时期及体内的肿瘤负荷量选择适当的方法，可以在不增加病人负担的前提下，对病人体内肿瘤负荷实行动态监测，为实施临床干预提供可靠的依据。
【】
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