可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的构建与鉴定
作者：孙万军 徐东刚 胡海兰 邹民吉 杜建芳
王金凤 蔡欣 王嘉玺 艾辉胜
【摘要】 为制备HLA?A*0201?PR1四聚体，本课题构建了可溶性的HLA?A*0201?PR1复合物。以原核表达的HLA?A*0201?BSP融合蛋白为重链， β2?微球蛋白（β2 m）为轻链，与人工合成的HLA?A2限制性抗原肽PR1（蛋白酶3的第169?177氨基酸，VLQELNVTV）进行共折叠复性，以生成可溶性HLA?A*0201?PR1复合物。应用BirA酶对复性混和物进行生物素化，再经阴离子交换柱纯化，得到生物素化的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物。应用凝胶过滤高效液相色谱分析可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的生成率。利用HLA?A2构象特异性抗体(BB7.2)及链霉亲和素进行Western blot和ELISA分析，对生物素化的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物进行鉴定。结果表明：在折叠体系中，主要含有HLA?A*0201?BSP聚合体、HLA?A*0201?PR1复合物及β2 m，其中可溶性复合物生成率约18%。获得的HLA?A*0201?PR1复合物可在BirA酶作用下被有效生物素化。结论：成功地获得了生物素化的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物，为进一步制备HLA?A*0201?PR1四聚体创立了基础。
【关键词】 HLA?抗原肽复合物； HLA?A*0201?PR1复合物； HLA?A*0201?PR1四聚体
Construction and Characterization of Soluble HLA?A*0201?PR1 Complex
Abstract This study was aimed to construct the soluble HLA?A*0201?PR1 complex for preparation of HLA?A*0201?PR1 tetramer. The recombinant HLA?A*0201?BSP (BirA substrate peptide) fusion protein as heavy chain and β2?microglobulin ( β2 m) as light chain were expressed highly as insoluble aggregates in Escherichia coli and then purified with gel filtration, and the final purity reached above 90%.The two subunits were refolded to form an HLA?A*0201?peptide complex by dilution method in the presence of an antigenic peptide PR1, a HLA?A2?restricted peptide from proteinase 3 (aa 169?177，VLQELNVTV). Refolded HLA?A*0201?PR1 complex was biotinylated using a BirA enzyme and purified by anion exchange chromatography on a Q?Sepharose (fast flow) column. The extent of reconstitution of the HLA?A*0201?PR1 complex was analyzed by HPLC gel filtration. The refolded and biotinylated products were detected by Western blot and ELISA with monoclonal antibody BB7.2 that recognized the natural conformations of HLA?A2 and streptavidin. The results showed that the refolded complex was composed of HLA?A*0201?BSP aggregate, HLA?A*0201?PR1 complex and β2 m, and reconstitution yields of 18% with PR1 was obtained. Refolded HLA?A*0201?PR1 complex could be confirmed by practical immunological method and biotinylated efficiently. It is concluded that the refolding and biotinylation of HLA?A*0201?PR1 complex is successfully obtained. This work provides the basis for the preparation of HLA?A*0201?PR1 tetramer.
Key words HLA?antigenic peptide complex; HLA?A*0201?PR1 complex; HLA?A*0201?PR1 tetramer
1996年，Altman等［1］创建MHCⅠ类分子?肽四聚体技术，首次实现了对抗原特异性CD8+细胞毒T细胞（CTL）的直接定量检测。自该技术问世以来，因其高度的敏感性、特异性和高效性，被迅速广泛地用于研究涉及T细胞免疫应答的病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病，并逐渐成为核心技术之一［2-4］。
2006-02-16 收稿；2006-10-25 接受 在体外通过基因工程方法获得可溶性的MHCⅠ类分子?肽复合物单体，是制备四聚体的基础。本研究以HLA?A*0201?BSP为重链， β2?微球蛋白（ β2 m）为轻链，与人工合成的HLA?A2限制性抗原肽PR1（蛋白酶3的第169?177氨基酸，VLQELNVTV）在体外进行共折叠复性，制备了具有天然构象的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物，并可在BirA酶作用下被有效生物素化。此为进一步制备HLA?A*0201?PR1四聚体、定量检测白血病患者在异基因造血干细胞移植（allo?HSCT）后体内PR1特异性CD8+ CTL奠定了基础。
材料
可生物素化HLA?A*0201?BSP重链和β2m轻链 HLA?A*0201?BSP和β2m的表达与纯化见［5，6］。
抗原肽 HLA?A*0201限制性抗原肽PR1（VLQELNVTV）由上海生工生物工程技术服务公司合成，HPLC纯化，纯度＞95%。
单克隆抗体 BB7.2为针对HLA?A2分子α2结构域特定表位的，仅与具有天然构象的可溶性HLA?A2分子结合，而不与变性形式的单独重链或轻链结合的鼠抗人单克隆抗体，购自Santa Cruz Biotechnology公司。
其它 BirA酶购自Avidity公司。高效液相色谱分析仪由军事医学院仪器测试分析中心提供，型号HP1100，凝胶过滤柱型号BIO?SIL SEC?125。Q?Sepharose（Fast Flow）购自Pharmacia公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体，HRP标记的链霉亲和素购自北京中山生物技术有限公司。精氨酸盐酸盐、氧化型/还原型谷胱甘肽（GSSG/GSH）、苯甲基磺酰氟（PMSF）等为Roche公司产品。
方法
HLA?A*0201?BSP、 β2 m 和PR1抗原肽的共折叠复性 参考Garboczi等［7］报道的稀释法。步骤大致如下：在200 ml预冷的折叠缓冲液（100 mmol/L Tris?HCl pH 8.0，含400 mmol/L Arginine?HCl、2 mmol/L EDTA、5 mmol/L GSH、0.5 mmol/L GSSG、0.2 mmol/L PMSF）中，顺序加入PR1抗原肽、β2 m、HLA?A*0201?BSP（分3次加入，每次间隔12小时），使其终浓度分别达10 μmol/L、2 μmol/L、3 μmol/L。在10℃反应36小时。在反应结束后，对折叠产物进行透析，透析液为20 mmol/L Tris?HCl（pH 8.0，含0.2 mmol/L PMSF）。透析后再用聚乙二醇20000浓缩，使终体积为5 ml。浓缩的样品经离心去除沉淀后，即可进行生物素化。
凝胶过滤高效液相色谱分析 应用凝胶过滤高效液相色谱分析复性混和物中HLA?A*0201?PR1复合物的生成率。取透析并浓缩后的复性混和物20 μl上样，以20 mmol/L Tris?HCl（pH 8.0，含150 mmol/L NaCl）为流动相，流速0.5 ml/min。收集各组分后以SDS?PAGE进行分析。
可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的鉴定 ①Western blot：将浓缩后的复性混和物进行非变性PAGE后，将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上，以封闭液（TBS，pH 7.5，含5%牛血清白蛋白）4℃封闭4小时，加入单克隆抗体BB7.2，4℃孵育4小时，洗膜后加入HRP?羊抗小鼠IgG抗体4℃孵育2小时，最后以4?氯?1?萘酚显色。②ELISA：用复性混和物包被ELISA板，4℃过夜。用5% BSA封闭24小时。加入单克隆抗体BB7.2孵育2小时，再加入HRP?羊抗小鼠IgG抗体37℃孵育1小时，最后加TMB室温反应15分钟。以2 mol/L H2SO4终止反应后，于波长450 nm检测A值。
可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的生物素化和纯化［8］ 按BirA酶使用说明书对HLA?A*0201?PR1复合物进行生物素化。反应体系为1体积的Biomix A，1体积的Biomix B，8体积的底物溶液。每10 nmol底物用2.5 μg BirA酶催化。30℃反应40分钟。反应完成后混和液对20 mmol/L Tris?HCl（pH 8.0）透析，离心去除沉淀后，上Q?Sepharose柱，以0-300 mmol/L NaCl线性梯度洗脱，各组分以SDS?PAGE进行分析。合并含HLA?A*0201?PR1的组分，透析后以Amicon Ultra?4（截留分子量10 kD）离心超滤浓缩至200 μl左右，加4 ml PBS后再浓缩至200 μl，测定蛋白浓度，置-70℃备用。
生物素化HLA?A*0201?PR1复合物的Western blot鉴定 将生物素化的产物进行非变性PAGE后，将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上。经封闭、加入HRP?链酶亲合素孵育洗涤后，用4?氯?1?萘酚显色。
结 果
可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的生成
在共折叠复性后，取适量复性混和物样品进行凝胶过滤高效液相色谱分析。同时设立对照组，即折叠体系中仅有HLA?A*0201?BSP，或仅有β2m，以及折叠体系中有HLA?A*0201?BSP和β2m，但无PR1抗原肽存在。图1（A）显示HLA?A*0201?BSP峰在8.7分钟出现。图1（B）显示β2m峰在10.2分钟出现。图1（C）显示复性混和物样品中，除了HLA?A*0201?BSP峰（9.0分钟）、β2 m峰（10.7分钟）外，在5.0分钟和7.1分钟各出现一个峰，对收集的组分进行SDS?PAGE分析后证实5.0分钟出现的峰是HLA?A*0201?BSP聚合体，而7.1分钟出现的峰是可溶性HLA?A*0201?PR1复合物。经峰面积，显示可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的生成率约为18%。图1（D）则显示，当折叠体系中无PR1存在时，仅出现HLA?A*0201?BSP聚合体、HLA?A*0201?BSP和β2 m所对应的峰。
Figure 1. Gel filtration HPLC profiles of HLA?A*0201?PR1 reconstitution from recombinant heavy chain and β2 m with and without peptides. (A) heavy chain. (B) β2 m. (C) PR1:VLQELNVTV. (D) no peptide.
可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的生物素化和纯化
在共折叠复性后，复性混和物经透析、浓缩并离心去除沉淀后，即可利用BirA酶进行生物素化。BirA酶可特异的在HLA?A*0201重链C端融合的BirA酶底物肽（BSP）的赖氨酸残基上标记生物素。生物素化后的产物上Q?Sepharose柱纯化，以NaCl线性梯度洗脱下三个峰(图2)。HLA?A*0201?PR1复合物在SDS?PAGE显示两条主带，即分子量约33 kD的HLA?A*0201?BSP和12 kD的β2 m。SDS?PAGE分析显示，第Ⅰ峰为β2 m（图3，lane 1-2），第Ⅱ峰为可溶性的HLA?A*0201?PR1复合物（图3， lane 3-4），第Ⅲ峰为非蛋白成分（图3， lane 5-6）。将含纯HLA?A*0201?PR1复合物的组分合并，超滤浓缩，浓缩后蛋白浓度为2 mg/ml。
可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的鉴定
利用单克隆抗体BB7.2仅与具有天然构象的可溶性HLA?A2分子结合的特性，通过Western blot和ELISA鉴定稀释法复性后生成的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物。将复性混和物、生物素化的复性混和物及经Q?Sepharose柱纯化获得的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物进行非变性PAGE，结果见图4（A）。可溶性HLA?A*0201?PR1复合物呈现一条带，位置与复性混和物、生物素化的复性混和物所呈现的中间条带相对应。用单克隆抗体BB7.2进行Western blot，结果见图4（B）。图中显示这3条带均能与单克隆抗体BB7.2结合，其中纯化的可溶性
HLA?A*0201?PR1复合物呈强阳性。复性混和物、生物素化的复性混和物所呈现的其它2条带不能与单克隆抗体BB7.2结合。这表明经过稀释法共折叠复性，生成了具有天然构象的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物。
用单克隆抗体BB7.2进行ELISA，结果见图5，可溶性HLA?A*0201?PR1复合物的A450值与空白对照的A450值相比较差异显著（P ＜0.05），而单独的重链、 β2m的A450值与空白对照的A450值相比较差异不显著（P ＞0.05）。
Figure 5. Identification of HLA?A*0201?PR1 complex by ELISA with mAb BB7.2.
生物素化HLA?A*0201?PR1复合物的鉴定
利用生物素与链霉亲和素之间的高亲和特性，可以对生物素化的折叠产物进行鉴定。用HRP?链酶亲合素进行Western blot，结果见图6。图中显示生物素化前的复性混和物为阴性，生物素化的复性混和物中呈现两条阳性带，纯化的生物素化的HLA?A*0201?PR1复合物为阳性。除了生物素化的HLA?A*0201?PR1复合物可与链霉亲和素结合外，生物素化的HLA?A*0201?BSP聚合体也可与链霉亲和素结合，故生物素化的复性混和物中呈现两条阳性带。
讨 论
蛋白酶3（P3）是一种存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中的丝氨酸蛋白酶。尽管P3未在正常造血干/祖细胞上检测到，但在髓系白血病细胞却高表达［9］，因此被认为是一个重要的白血病相关抗原。PR1是P3的一个HLA?A2限制性的抗原表位，PR1特异性CD8+ CTL可选择性攻击P3高表达的白血病细胞，对正常细胞无明显影响［10］。为制备检测PR1特异性CTL的HLA?A*0201?PR1四聚体，首先需利用蛋白质体外折叠技术制备HLA?A*0201?PR1复合物单体。目前在制备MHCⅠ类分子—肽四聚体时，多采用Garboczi等创建的稀释复性法获得单体，单体得率一般在10%-15%。我们亦此法制备HLA?A*0201?PR1复合物单体。为避免其他杂蛋白对折叠的干扰，我们应用了经凝胶过滤纯化、纯度＞90%的HLA?A*0201?BSP和β2 m重组蛋白。在稀释复性后，HLA?A*0201?PR1复合物单体得率可达18%。
研究表明，原核表达的HLA?A2分子的重链只有在β2 m、抗原肽均存在的前提下才能够复性，并与之折叠形成正确的HLA?A2单体构象［11］。我们通过凝胶过滤高效液相色谱方法分析证实，当折叠体系中缺乏PR1抗原肽时，HLA?A*0201?BSP无法复性转而形成聚合体；当折叠体系中，PR1、 β2 m、HLA?A*0201?BSP三者的比例协调时，则有利于生成HLA?A*0201?PR1复合物单体。利用单克隆抗体BB7.2进行Western blot和ELISA方法分析后证实，所获得的HLA?A*0201?PR1复合物单体具有天然构象。
我们在稀释复性后，对复性混和物进行透析、浓缩并去除沉淀后，直接进行生物素化，再以阴离子交换柱层析，获得了高纯度的生物素化的HLA?A*0201?PR1单体。此单体与PE?链酶亲合素直接耦合后，即可获得用于流式细胞术检测的四聚体，这无疑将简化四聚体的制备过程，也将减少产品在多次纯化过程中的损失。利用HRP?链酶亲合素进行Western blot分析后证实，HLA?A*0201?PR1单体已被有效生物素化。
近年来MHC?肽四聚体技术开始用于allo?HSCT后CMV特异性CTL、mHags特异性CTL和白血病抗原特异性CTL的检测，初步结果显示对CMV感染、GVHD、GVL的监测有着重要意义［12］。Molldrem等［13］研究发现，PR1特异性CTL可能在慢性髓细胞白血病患者allo?HSCT后产生的GVL效应中发挥重要作用。我们成功获得的可溶性HLA?A*0201?PR1复合物，为进一步制备HLA?A*0201?PR1四聚体奠定了基础。
【参考】
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